منبع پایان نامه درباره استاندارد، تغییر رنگ، نرم افزار

Expire Date: 2014/11
Stop solution، Lot Number: NN5998، Expire Date: 2014/07
پنی‌سیلین
این کیت (Explorer 2.0) بر پایه بازداری رشد میکروارگانیسم‌ها پایه‌گذاری شده است. کیت از لوله‌های منفرد تشکیل شده است که هر لوله شامل محیط کشت همراه با اسپور باکتری ترموفیلیک ژئوباسیلوس و یک اندیکاتور PH است.
در مرحله انکوباسیون در 65 درجه سانتیگراد اسپور شروع به رشد کرده و سلول‌ها اسید تولید می‌کنند و PH محیط را تغییر می‌دهند. تغیرات PH باعث تغییر رنگ محیط از آبی / بفنش به زرد می‌شود. وقتی دارای غلظت بالایی از باز دارنده بنابراین حد تشخیص کیت پایین آمده و هیچ‌گونه رنگی تغییر نمی‌کند. اجزای کیت باید در دمای 16 تا 14 درجه سانتی‌گراد نگهداری شوند و از برخورد مستقیم نور به آنها ممانعت شود. نیمه عمر کیت تولید شده حدود 9 ماه می‌باشد.کمترین مقداری که این کیت می‌تواند تشخیص دهد20ppb است.
تجهیزات مورد استفاده
Shaker
سانتریفیوژ (2000ˣg)
Sampler 1000, 100 µl
تویوپ 50 ml و 5 ml
پمپ خلا
Elisa reader
دستگاه HPLC
فاز متحرک: 10ml استات آمونیوم 1% اسید استیک و 95ml متانول و 5ml آب مخلوط می کنیم و صاف می کنیم.
ستون C18
طول موج (نانومتر): 220 پنی‌سیلین، 280 کلرامفنیکل، 320 تتراسایکلین
سرعت جریان: 1 ml/min
حجم تزریق: 25 میکرولیتر
نوع آشکارساز: UV
برنامه نرم‌افزاری برای کنترل سیستم و جمع‌آوری اطلاعات:milinium
کاتر
Zipe Kipe
Bag Mixer
Sigma 500cc
Plate
Pipet 10cc
ارلن مایر 500cc
ارلن مایر 250cc
لوله آزمایش
حلقه کشت
گرم خانه 37 درجه سانتی‌گراد
گرم خانه 42 درجه سانتی‌گراد
لام و لامل
کواکس
لوله دورهام
ترازو
سوزن کشت
روش اریمونواسی
ایمونواسی یک راه ساده و کوتاه از تقابل آنتی‌ژن و آنتی‌بادی است. این روش خیلی قوی و مؤثر برای اندازه‌گیری واحد‌های خیلی کوچک مانند ng/ml و pg/ml در محلول‌هایی همچون پلاسما، ادرار و محیط‌کشت‌های سوپرناتانت استفاده می‌شوند. به طور اساسی در روش ایمونواسی از یک آنزیم برای اتصال آنتی‌ژن به آنتی‌بادی استفاده می‌شود. این آنزیم باعث می‌شود که سوبسترای بی‌رنگ دارای یک رنگ خالص شوند که این امر نشان دهنده آنتی‌ژن به آنتی‌بادی است. این روش می‌تواند به صورت‌های مختلف آنتی‌ژن و آنتی‌بادی را شناسایی کند. این موضوع بستگی به طراحی آزمایش مورد نظر دارد.
بررسی باقیمانده تتراسایکلین‌ها با روش ایمونواسی
روش آماده‌سازی نمونه‌های
شیر:
ابتدا باید چربی شیر گرفته شود چون چربی شیر می‌تواند یکی از عوامل باشد که باعث مخدوش شدن جواب های آزمایش شود. PH شیر نیز باید در نظر گرفته شود چون شیر ترش شده می‌تواند کیفیت آزمایش را تحت تأثیر قرار دهد.
1-شیر سرد را در دما °c4 به مدت 15 دقیقه در دور 2000 سانتریفوژ کرده
2-به وسیله یک کاردک چربی جمع شده بر سطح نمونه را جمع آوری کرده
3-0/75ml از نمونه ای که چربی آن گرفته شده را به یک لوله تمیز منتقل می کنیم و 0/25ml MTC بافر به آن اضافه نمود و به وسیله vortex آن را محفوظ می کنیم.
4-100µl از شیر بدون چربی را در 200µl Sample dilution buffer اضافه کرده و سپس با vertex آن را مخلوط می کنیم.
5-μl 50این محلول را برای آزمایش الایزا استفاده می کنیم.
گوشت (قرمز، سفید):
1-1گرم از بافت گوشت را بریده و آن را چرخ می کنیم و در یک لوله تمیز می ریزیم.
2-./5mL آب مقطر به آن اضافه می کنیم و 1/5 mL متانول 100% سپس به وسیله vortex آن را به خوبی مخلوط می کنیم.ذ
3-در دمای °25-°20 در دور 2000 آن را سانتریفیوژ می کنیم.
4- 60 μl از محلول را بهdilution buffer350 μl اضافه کرده و آن را به وسیله vortex به خوبی مخلوط می کنیم.
5-50µl از محلول را برای آزمایش الایزا استفاده می کنیم.
تخم مرغ:
1-1گرم از یک تخم مرغ یک دست مخلوط شده را به یک لوله 15mL پلاستیکی اضافه می کنیم.
2-McIIvain buffer l mL با 1 PH به آن اضافه می گردد (1 : 1 با متانول رقیق می‌شود).
4- 50 μl از محلول سوپر ناتانت را به یک لوله تمیز جدید منتقل می کنیم و 200ml dilution buffer به آن اضافه می کنیم.
5-50μl از محلول را بر آزمایش الایزار استفاده می کنیم.
روش‌های آماده‌سازی محلول‌های مورد استفاده در آزمون :
Microtiter plate : نوارهایی که برای آزمایش قابل استفاده نیستند به سرعت باید به داخل یخچال برگردانده شود اما نوارهایی که باید برای آزمایش استفاده می‌شود باید به دمای محیط برسند.
در این کیت دو بافر وجود دارد TC buffer, dilution buffer M
Dilution buffer : بافر برای آماده سازی کونژوگه و Sample dilation buffer استفاده می‌شود و قبل از مصرف باید به نسبت 4 : 1 به وسیله آب مقطر رقیق شود. بافر دیگر به نام buffer MTC است که برای رقیق کردن نمونه شیر از آن استفاده می‌شود.
Sample dilution buffer : این بافر به صورت آماده در کیت وجود نداشته و باید آماده شود. Dilution buffer 18mL را به همراه 2mL متانول 100% مخلوط کرده آن را تا زمان استفاده در °c8 – °c2 نگهداری می‌کنیم.
McIIvain buffer : 0/2 از محلول سدیم دیباکسید را به همراه μ 0/2 از محلول تری سدیم سیترات دهیرات را آماده می کنیم و هر دو را با آب مقطر به حجم 1 لیتر می رسانیم دو محلول را مخلوط کرده و آن را با HCLبه PH 7می رسانیم قبل از مصرف با متانول به نسبت 1 : 1 باید رقیق شود.
Standarl 2ng/ml :
باید چند رقت از استاندارد تتراسایکلین تهیه شود. ابتدا 2ml sampel dilution buffer به استاندارد تتراسایکلین اضافه می کنیم این محلول حاوی 2ng تتراسایکلین در ml است. 0.25ml از این محلول را به یک لوله تمیز منتقل کرده و Sample dilution buffer 0.25ml به آن اضافه کرده این عمل را تکرار می‌کنیم تا رقت های 1/0 ، 0/5 ، 0/25 ، 0/025 ، 0/0625 را بسازیم.
Conjugate: ویال لیوفیلیزه کونژگه را با 6ml از dilution buffer مخلوط کرده و آن را در یک جای تاریک نگهداری می کنیم.
Rinsing buffer : محلول شستشو باید قبل از مصر به صورت تازه ساخته شود برای هر نوار 40mL محلول شستشو استفاده می‌شود.
Substrate/chrowogen sdution :
محلول سوبسترا به صورت آماده در کیت وجود دارد.
روش اجرایی آزمون الایزا
1-نمونه‌ها محلول‌های مورد استفاده در آزمون طبق دستور العمل‌ها ساخته می‌شود.
2- 100MLاز sam ple dliution buffer: در خانه‌های دوتایی H1 ، H2 می‌ریزیم که این خانه‌ها حاوی نمونه کنترل منفی می‌باشد.
Sample ditution buffer 50μl در خانه های دوتایی A2 و A1 می‌ریزیم که این خانه‌ها حاوی نمونه‌هایی کنترل مثبت می‌باشد.
50μl از هر محلول استاندارد در باقی خانه به صورت دوتایی می ریزیم B1 تا I1 که به ترتیب شامل 0.0625 ، 0.125 ، 0.25 ، 0.5 ، 1.5 و 2.0 ng⁄mL می‌باشد.
4- 50μl از محلول کونژوگه به تمام خانه ها اضافه می‌شود به غیر از خانه های H2 و H1
5-پلیت حاوی محلول ها را به روی یک شیکر گذاشته و برای دقایقی آن را به خوبی مخلوط می‌کنیم.
6-پلیت را برای 1 ساعت در مای 25°c تا 20°c در یک محل تاریک انکوبه می کنیم.
7- محتویات داخل پلیت را خالی کرده و 3 بار آن را با محلول شستشو می شویم.
8- 100μl از محلول سوبسترا به تمام خانه ها اضافه می کنیم.
9-پلیت را برای 30 دقیقه در دمای 25°c تا 20°c در یک محل تاریک انکوبه می کنیم.
10- 100μl از محلول stop را به تمام خانه ها اضافه می کنیم.
11-به سرعت پلیت را به وسیله دستگاه Elisa Reader در محلول موج 450nm می‌خوانیم.
12-توسط نرم افزار OD های بدست آمدره را محاسبه کرده.
روش شستشو
در این آزمون بین هر مرحله باید محتویات داخل پلیت باید شسته شود.
1-محتویات داخل پلیت را با برگرداندن آن خالی کرده و با کوبیدن پلیت بر روی یک دستمال تمیز آن را کاملاً تخلیه می کنیم.
2-تمام خانه های استفاده شده را با 300μl از محلول شستشو پر می کنیم.
3-این عمل 3 بار باید انجام شود.
4-پلیت را با کوبیدن بر روی یک دستمال تمیز کاملاً خشک می کنیم.
5- باید توجه داشت که تمام خانه ها به طور کامل خشک شده و قطره ایی از محلول شستشو باقی نمانده باشد.
بررسی باقیمانده کلرامفنیکل با روش ایمونواسی
روش آماده‌سازی نمونه‌ها
شیر:
نمونه‌های برای آزمایش به صورت مستقیم باید به نسبت 1 به 4 با sample dilution buffer رقیق شود.
روش مستقیم: برای انجام این آزمون به صورت مستقیم باید چربی شیر به صورت دائمی گرفته شود و گرنه باعث مخدوش شدن جواب آزمون می‌شود.
دیگر فاکتور تأثیرگذاری برروی آزمون PH نمونه‌ها شیر است. شیری که PH اسیدی دارد باعث به وجود آمدن خطا در آزمون می‌شود.
شیر سرد را برای 15 دقیقه در دور2000 در دمای 4 درجه سانتگیراد.سانتریفیوژ می کنیم. فاز بالایی محلول را که چربی شیر می‌باشد را با کاردک جمع می‌کنیم. شیر بدون چربی را با نسبت 1 به 4 با sample dilution buffer رقیق می‌کنیم.
sample dilution buffer 300μl را به 100 میکرولیتر شیر اضافه می‌کنیم 50 میکرولیتر آن را برای آزمون استفاده می‌کنیم.
تخم مرغ:
1 گرم از یک تخم مرغ کاملاً یک دست و یکنواخت را به یک لوله تمیز انتقال می‌دهیم 6 mlاتیل استات به آن اضافه کرده و آن را به مدت 1 دقیقه کاملاً مخلوط می‌کنیم. هنگامی که آن را به شدت مخلوط کنیم محلول مورد نظر تبدیل به یک ژله می‌شود. بعد آن را به مدت 10 دقیقه دردور 2000 سانتریفیوژ می کنیم.3 ml از لایۀ رویی را به یک لوله تمیز منتقل می‌کنیم.
محتویات لوله را در 50 درجه سانتیگراد زیر بخار نیتروژن تبخیر می‌کنیم به چربی باقیمانده 1mlاِن هگزان و 0/5 ml با sample dilution buffer اضافه می‌کنیم و آن را به مدت 1 دقیقه مخلوط می‌کنیم و بعد آن را به مدت 10 دقیقه در دور2000 سانتریفیوژ می‌کنیم. سپس لوله را به مدت 5 دقیقه در حمام آب گرم در دمای °80 می‌گذاریم و سپس دوباره سانتریفیوژ می‌کنیم. 50 میکرولیتر از لایۀ زیرین از محلول را برای آزمون اصلی بر می‌داریم.
گوشت:
استخراج به وسیله اتیل استات صورت می‌گیرد. ابتدا باید به صورت کامل گوشت چرخ شود و به یک مخلوط همگن تبدیل شود3gr از مخلوط را برداشته و به یک لوله تمیز منتقل می‌کنیم و 6ml اتیل استات به آن اضافه می‌کنیم و به مدت 10 دقیقه آن را مخلوط می‌کنیم. سپس آن را به مدت 10 دقیقه در دور 2000 سانتریفیوژ می‌کنیم 4ml از محلول رویی را برداشته، و به یک لوله تمیز دیگر منتقل می‌کنیم و سپس در دمای 50 درجه سانتیگراد زیر بخار نیتروژن آن را تبخیر می‌کنیم.
به چربی باقی مانده 1ml اِن هگزان و1ml sample dilution buffer اضافه کرده و بعد آن را به مدت 1 دقیقه به شدت مخلوط می‌کنیم و سپس به مدت 10 دقیقه آن را سانتریفیوژ کرده سپس لوله را به مدت 5 دقیقه در یک حمام آب گرم در دمای 80 درجه سانتیگراد گذاشته. لوله مورد نظر با محتویات داخل آن سانتریفیوژ کرد، و 50 μl از مایع زیرین را برداشته و برای آزمون اصلی از آن استفاده می‌شود.
ر وش آماده سازی محلول های مورد استفاده در آزمون
از تمام مواد و محلول‌های داخل کیت می‌توان برای یک پلیت 96 خانه‌ای استفاده کرد از هر استاندارد و نمونه باید به صورت دوتایی برای آزمون استفاده کرد.
Micro titre plate : نوارهایی که برای آزمایش قابل استفاده نیستند به سرعت باید داخل یخچال برگردانده شود اما نوارهایی که باید برای آزمایش استفاده شود باید به دمای محیط برسند.
Rinsing buffer : محلول شستشو باید قبل از مصرف به صورت تازه ساخته شود برای هر نوار 40mL محلول شستشو استفاده می‌شود.
substrate: محلول

مطلب مشابه :  پایان نامه با کلید واژه هایچرخه عمر، بازده سهام، وجوه نقد

دیدگاهتان را بنویسید