منبع پایان نامه درباره استاندارد، صنایع مواد غذای، بیوتکنولوژی

سوبسترا به صورت آماده در کیت وجود دارد.
Conjugate : ویال لیوفیلیزه را با 4ml از با reconstitution/zerostandard buffer مخلوط کرده و آن را در یک محل تاریک نگه می‌داریم.
antibody : ویال لیوفیلیزه را با 4ml از reconst itution /zero standard buffer مخلوط کرده و در یک محل تاریک نگه می‌داریم.
sample dilution buffer : این بافریی که در کیت وجود دارد 4 بار غلیظ شده است بنابراین قبل از مصرف باید با آب مقطر رقیق شود. 20ml از بافر باید با 40ml از آب مقطر رقیق شود. باید قبل از مصرف به دمای اتاق رسیده کاملاً به هم زده شود.
Standard (100ng/ml) : برای ساخت رقت‌های استاندارد باید از محلول استانداری که حاوی 100ng/ml کلرامفنیکل است استفاده شود باید رقت های 4 ، 1 ، 0.4، 0.2 0.04ng/ml ساخته شود. این رقت‌ها به صورت آماده درکیت وجود دارد.
بررسی باقیمانده پنی‌سیلین
نحوه آماده‌سازی نمونه‌ها:
1- 3 گرم از نمونه گوشت را برداشته و به قطعات کوچک تبدیل می‌کنیم.
2- نمونه قطعه قطعه شده را در یک تویوپ شیشه‌ای یا پلاستیکی که قطر آن حدوداً cm 1/5 باشد بریزید که به گرما مقاوم باشد. درب آن را ببندید اما درب تویوپ را خیلی محکم نکنید.
3- تویوپ را در میکروویو گذاشته زمان در این مرحله نقش بسیار مهمی را ایفا می‌کند که حدوداً باید بین 2-1 دقیقه باشد.
4- نمونه را با استفاده از یک وسیله کوبنده آن را کاملاً می‌کوبیم تا یک شیره مناسب از آن استخراج شود.
5- µl 100 از شیره استخراج شده را برای انجام آزمون استفاده می‌کنیم.
1-زرده وسفیده تخم مرغ را در یک تویوپ تمیز می ریزیم به هم می زنیم تا یک ماده یکنواخت به دست اید
2-1میلیتر از نمونه را با 3 میلیتر آب مقطر مخلوط کرده و در یک تیوپ پلاستیکی مقاوم به حرارت به قطر 1/5 cm میریزیم و حرارت می دهیم
3-نمونه ها را به مدت 12 دقیقه در دمای 100 در حمام اب گرم قرار می دهیم
4-به مدت 30-20 ثانیه آن را مخلوط می کنیم تا از لخته شدن آن جلوگیری کنیم و سپس آن را در دمای اتاق می گذاریم تا سرد شود
5-100میکرولیتر از مخلوط را برای آزمون استفاده می کنیم.
برای آماده سازی نمونه های شیر به روش تخم مرغ عمل می کنیم.
نحوه انجام آزمون:
1- با یک قیچی تعداد تویوپی که برای آزمون نیاز هست را بریده و استفاده می‌کنیم. مواظب باشید که فویل یا سرپوش تویوپ‌های باقی مانده برداشته نشود تا از خشک شدن آن‌ها جلوگیری شود و به سرعت آن را به دمای 16-4 درجه سانتیگراد برگردانید.
2- تویوپ‌ها را برای حفاظت بیشتر در یک جعبه به صورت ایستاده نگهداری کنید سرپوش‌های تویوپ را برداشته و ml 100 از نمونه آماده شده را توسط پیتی که در کیت وجود دارد به تویوپ‌ها اضافه کنید. می توان یک نمونه کنترل منفی یا یک نمونه کنترل مثبت که با اسقفاده از استانداردهای آنتی‌بیوتیک مورد نظر آلوده شده در یک تویوپ دیگر در کنار تویوپ حاوی نمونه داشته باشیم.
3- تویوپ‌ها را برای 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.
4- تویوپ‌ها را برگردانده و محتویات آن را خارج کنید. تویوپ‌ها را با آب مقطر چند بار پر و خالی کنید تا شسته شوند. تمام آب مورد شستشو را با برگرداندن تویوپ بر روی یک دستمال یا حوله کاملاً خارج کنید تا قطره‌ای آب در تویوپ باقی نماند. برای 4 بار عمل شستشو را انجام دهید.
5- تویوپ‌ها را با یک سرپوش چسبنده پوشانده و آن را در دمای 65 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
6- هنگامی که نمونه کنترل منفی به رنگ زرد درآمد باید انکوباسیون متوقف شود. که حدوداً مدت زمان برای دیدن این نشانه 3-2 ساعت است.
7- تویوپ‌ها را از کنار نگاه کنید و نتیجه را بخوانید و هر نمونه را با نمونه کنترل منفی مقایسه کنید.
رنگ بنفش مایل به قهوه‌ای نشانه مثبت بودن و رنگ زرد نشانه منفی بودن آزمون است. هر رنگی به غیر از رنگ نمونه کنترل منفی نشانه این است که نمونه‌ها حاوی آنتی‌بیوتیک هستند. اگر جواب‌های بدست آمده مشکوک باشد باید آزمون دوباره انجام شود.
روش کوروماتوگرافی مایع
کروماتوگرافی مایع در اواخر دهه 1960 و اوایل دهه 1970 کشف شد. امروزه به طور گسترده از آن برای خالص سازی و استخراج مواد استفاده می‌کنند. در صنایعی همچون داروسازی، بیوتکنولوژی، پلیمر و صنایع مواد غذایی از آن استفاده می‌شود. بیشتر از یک دهه است که کوروماتوگرافی مایع به عنوان یک روش مؤثر برای انواع مواد به کار گرفته شده است.
در روش کوروماتوگرافی مایع نیاز به مواد فرار نیست. در نتیجه این یک مزیت نسبت به روش GC به حساب می‌آید. کوروماتوگرافی مایع براساس تزریقی کوچک از نمونه مایع در یک بخار مایع به نام فاز متحرک استوار است. که در یک ستون با ذره‌هایی ثابت محصور شده است.
جداسازی مخلوط مورد نظر و اجزای تشکیل دهنده آن به درجه تحمل و نگهداری هر جزء در ستون بستگی دارد. اندازه هر جزء در ستون به وسیله جزء‌بندی بین فاز مایع متحرک و فاز ساکن تعیین می‌گردد. در کوروماتوگرافی مایع این جزء‌بندی بر اثر تقابل مواد حل نشده موجود در فاز ساکن و مواد حل نشده در فاز مایع است. بنابراین برعکس روش GC هر تغییر در فاز مایع باعث یک تغییر بزرگ بر روی جداسازی مواد می‌شود. وقتی مواد تحرک مختلف داشته باشند در زمان‌های مختلفی در ستون دیده می‌شوند.
جدا کننده‌های مختلفی وجود دارند که می‌توان در فاز مایع از آن استفاده کرد. این دستگاه مواد موجود در فاز مایع را شناسایی می‌کند و آن را به سیگنال‌های الکتریکی برمی‌گرداند. قابل ذکر است هرگونه تغییر در شرایط اپراتور باعث می‌شود که بر روی زمان نگهداری و ابقا تاثیر گذار باشد و باعث مخدوش شدن جواب نهایی گردد. زمان ابقا زمانی است که بین تزریق و جداسازی تعریف شده است. در ادامه اجزاء دستگاه HPLC را توضیح می‌دهیم.
فاز متحرک
انتخاب صحیح ترکیب درصد و نوع فاز متحرک در انجام مؤثر آزمایش‌ها بسیار مهم می‌باشد، زیرا فاز متحرک متغیری است که برای جداسازی موفق نقش مهمی برعهده دارد. اما دامنه انتخاب ما به دلیل ستون و فاز ساکنی که انتخاب می‌کنیم محدود است و تمایز (مشخصه) اصلی بین کروماتوگرافی فاز معکوس و فاز نرمال می‌باشد. در سیستم فاز نرمال، حلال‌های غیرقطبی مانند هگزان یا ایزواکتان به کار می‌رود. در حالیکه در فاز معکوس از حلال‌های قطبی مانند انتخاب فاز متحرک مناسب با توجه به خواص فیزیکی حلال انجام می‌گیرد. فاکتورهایی که در این گزینش می‌تواند به ما کمک کند عبارتند از: قطبیت، قابلیت حل شدگی با حلال‌های دیگر، بی اثر بودن از لحاظ شیمیایی، طول موج نقطه قطع فرابنفش و سمیت. ضریب قطبیت معیاری از قابلیت یک حلال برای شستن یک جزء از درون ستون است.
در جدول 3-1 خلاصه‌ای از حلال‌های رایج که به عنوان فاز متحرک مورد استفاده قرار می‌گیرند ارائه شده و همچنین به بعضی از پارامترها که نقش مهمی در انتخاب فاز متحرک مناسب دارند اشاره شده است.
جدول ‏31: حلال‌های متداول برای فاز متحرک در HPLC
حلال
ضریب قطبیت
طول موج قطع (nm)UV
سمیت
فاز نرمال
هگزان
1/0
210
سمت عصبی مزمن
ایزواکتان
1/0
205
کم
دی اتیل اتر
8/2
218
کم
دی کلرومتان
1/3
245
سرطان زا
ایزوپروپیل الکل
9/3
205
کم
فازبرگشتی
آب
2/10
200
غیرسمی
متانول
1/5
210
سمیت متوسط
استونیتریل
8/5
210
سمی توسط استنشاق (تنفس)
تتراهیدروفوران
0/4
280
سمی توسط استنشاق (تنفس)
سیستم HPLC را می‌توان برای دو نوع شستشو تنظیم کرد: تک شویی و گرادیانی.
* شستشوی تک شویشی در جایی استفاده می‌شود که ترکیب فاز متحرک در خلال آزمایش ثابت می‌ماند.
* شستشوی گرادیانی در جایی استفاده می‌شود که ترکیب فاز متحرک در خلال آزمایش برای کسب تفکیک بهتر، همراه با کاهش زمان آزمایش، مکرراً تغییر می‌یابد.
پمپ
مهم‌ترین وظیفه پمپ در سیستم HPLC عبور دادن مداوم فاز متحرک در درون ستون کروماتوگرافی است. دو نوع اصلی پمپ برای سیستم HPLC وجود دارد. سرنگی و پیستونی.
پمپ سرنگی
پمپ‌های نوع سرنگی به دلیل اینکه بدون ضربان (پالس) عمل می‌کنند، برای انجام آزمایش جذابیت بیشتری دارند. ولی حجم کل فاز متحرکی که می‌توان با این نوع پمپ‌ها به ستون تحول داد محدود است، زیرا پمپ سرنگی ظرفیت کمی دارد. این پمپ‌ها در مقایسه با پمپ‌های پیستونی گران‌ترند.
پمپ پیستونی
چرخش یک چرخ دنده مرکزی موجب حرکت دو پیستون به شیوه متقابل (جایگزینی) می‌شود. این امر به نوبه خود فاز متحرک را از مخزن کشیده و با فشار آن را به سوی ستون می‌فرستد.
سوپاپ اطمینان وقتی مایع از آن عبور می‌کند باز، و وقتی که عبور نمی‌کند خود به خود بسته می‌شود با هر حرکت بالا و پایین رفتن، سوپاپ‌ها باز و بسته می‌شوند. به این ترتیب اطمینان حاصل می‌شود که جریان حرکت فاز متحرک از مخزن به ستون همیشه یک طرفه باقی بماند. حجم فاز متحرکی که با هر چرخش کامل چرخ دنده از مخزن به ستون منتقل می‌شود برابر است. این سیستم طرح نسبتاً ساده‌ای دارد که به دلیل داشتن یک مخزن بزرگ توان بالایی در استمرار ورود فاز متحرک به ستون را دارد. سرعت جریان عبور فاز متحرک را می‌توان به سادگی از طریق تغییر در سرعت موتور (چرخ دنده) بالا یا پایین بود. یکی از معایب این نوع پمپ ایجاد ضربان در فاز متحرک است.
انژکتور (محل تزریق)
انژکتور در HPLC برخلاف کروماتوگرافی گازی عموماً دارای طرحی ساده است. نمونه از طریق یک سرنگ وارد حلقه می‌شود و مقدار کافی از نمونه حلقه را پر می‌کند. مایع اضافی از طریق دریچه‌ها خارج شده، سپس انژکتور به وضعیت تزریق تغییر وضعیت می‌دهد. در این حالت ابتدای این حلقه به پمپ و انتهای آن به ستون وصل است. نمونه موجود در درون حلقه توسط جریان فاز متحرک به بالای ستون منتقل می‌شود. چنین طرحی به حلقه انژکتور این توانایی را می‌دهد که محیط با فشار ثابتی پر گردد. این امر موجب می‌شود که فشار برگشتی حاصله از ستون کاهش یابد. همچنین از نشت انژکتور و سپتوم هم جلوگیری می‌کند. به این دلیل که حجم حلقه مشخص است، پروسه تزریق از قابلیت تکرارپذیری بالایی برخوردار است و به سیستم HPLC این توانایی را می‌دهد که برای سنجش‌های کمی مورد استفاده قرار گیرد. حلقه‌ها قابل تعویض هستند، پس این امکان را فراهم می‌کند که بتوان حجم تزریق را بر اساس میزان مورد نیاز انتخاب نمود.
ستون
ستون مهم‌ترین قسمت یک دستگاه کروماتوگرافی است و در تعیین کارآیی و قدرت تفکیک کل سیستم HPLC نقش حیاتی دارد. تصمیم‌گیری برای انتخاب ستون در درجه اول به نوع کروماتوگرافی مورد استفاده بستگی دارد. برای مثال کروماتوگرافی فاز نرمال یا فاز برگشتی.
برای جزئیات بیشتر تجزیه گر باید به راهنمای سازندگان ستون مراجعه کند. امروزه بسیاری از سازندگان ستون‌ها، وب سایت مخصوص خود را دارند، که با مراجعه به آن می‌توان اطلاعات مفیدی درباره انواع ستون‌ها و کاربردی‌های مناسب آن کسب نمود.
جدول ‏32: فازهای ساکن HPLC و کاربردهای رایج آنها
فاز ساکن
نوع
کاربرد
فاز متحرک
آنالیت‌های رایج
سیلیکا
فاز نرمال
هگزان، الکل‌ها
حشره‌کش‌ها و محصولات طبیعی
اکتادسیل سیلیل (ODS)
زنجیر هیدروکربنی C18
فازبرگشتی
آب، متانول، استونیتریل، بافرها (pH:8-2)
پپتیدها و آمینواسیدها
‍C8
زنجیر هیدروکربنی C8
فاز برگشتی
ODS را ببینید
داروها و ترکیبات دارویی
سیانوپروپیل (CN)
گروه سیانوپروپیل پیوند یافته با نگهدارنده سیلیکا
فاز نرمال و فاز برگشتنی
فاز برگشتی: آب، الکل
فاز نرمال: هگزان، اتر
غذا و اسیدهای چرب
آمینوپروپیل (CH2)
گروه آمینوپروپیل پیوند یافته با نگهدارنده سیلیکا
فاز نرمال و فاز برگشتنی
فاز برگشتی: آب، الکل
فاز نرمال

مطلب مشابه :  منابع و ماخذ تحقیقاندازه گیری، نفوذپذیری، صنایع غذایی

دیدگاهتان را بنویسید