تحقیق درمورد اندازه گیری و بهینه سازی

دانلود پایان نامه

در مرحله اول تخلیص، با توجه به مقاومت دمایی آنزیم TTL، رسوب دهی دمایی مخلوط پروتئینی در دمای °C 65 در بن ماری به مدت 40 دقیقه و بلافاصله یخ گذاری به مدت 30 دقیقه به منظور حذف پروتئین های غیر مقاوم به دما انجام گردید. سپس با سانتریفوژ دور rpm 13000 پروتئینهای دناتوره شده رسوب داده شدند و محلول رویی به عنوان نمونه پروتئینی با خلوص نسبی مورد استفاده قرار گرفت. مقداری از آنزیم نیز جهت استفاده به صورت پودر خشک به کمک دستگاه فریزدرایر لیوفیلیز شد.
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی
جهت انتخاب بهترین زمان حرارتدهی برای رسیدن به بیشترین خلوص ممکن و ایجاد کمترین آسیب به آنزیمهای TTL موجود در مخلوط پروتئینی، عصاره سلولی باکتری حاوی پروتئین نوترکیب (TTL)، به 6 بخش تقسیم شد و هر کدام به مدت زمان مشخصی (30، 40، 50، 60، 70 و 80 دقیقه) در دمای °C 65 قرار داده شد. پس از یخگذاری نمونهها، پروتئینهای دناتوره شده به کمک سانتریفوژ جدا شدند و μg 12 از پروتئینهای مقاوم به حرارتدهی باقیمانده در محلول مربوط به 6 نمونه، به همراه بافر نمونه حاوی رنگ، وارد چاهکهای SDS-PAGE شد(بخش 3-3-5) و بهینه مدت زمان رسوبدهی دمایی مشخص گردید.
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی
در این مرحله از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی Q- سفاروز با شیب نمکی سدیم کلرید در محدوده 0 تا 5/0 مولار در pH 8 بافر تریس استفاده شد. پس از تشخیص غلظت بهینه نمک برای جداسازی آنزیم TTL(حدود غلظت 15/0)، به صورت مرحلهای و طی 3 مرحله غلظتی از نمک سدیم کلرید (مرحله اول: غلظت 0، مرحله دوم: غلظت 1/0 مولار، مرحله سوم: غلظت 15/0 مولار) آنزیم TTL از سایر پروتئینهای مخلوط پروتئینی جدا گردید.
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین
در این پژوهش از دو روش مختلف جهت اندازه گیری کمی میزان پروتئین استفاده شد:
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد
محلول برادفورد طبق جدول 3-5 تهیه گردید. ابتدا پودر کوماسی بلو به مدت 1 تا 2 ساعت در تاریکی با اتانول بر روی استیرر حل میکنیم. در ادامه اسید فسفریک را به آن افزوده و حجم آن را با آب مقطر به 1000 میلیلیتر میرسانیم. سپس محلول برادفورد تهیه شده را با کاغذ واتمن فیلتر کرده و در ظرف تیره نگهداری میکنیم.
جدول 3-5- نحوه تهیه محلول برادفورد
مواد مورد نیاز
مقدار
Comassie Brilliant Blue G-250
1/0 گرم
اتانول 95%
50 میلیلیتر
فسفریک اسید 85%
100 میلیلیتر
در روش برادفورد در اثر برهمکنش اختصاصی رنگ کوماسی بلو G-250 با آمینواسیدهای آروماتیک پروتئین (آرژینین، تریپتوفان، تیروزین، هیستیدین، فنیلآلانین) در محلول اسیدی (در فرم آنیونی آمینواسیدها)، رنگ آبی ایجاد میشود که شدت این رنگ در غلظتهای کم پروتئین نزدیک به قهوهای و در غلظتهای بالا آبی تیره است. میزان جذب نوری محلول پروتئینی به همراه معرف رنگی در 595 نانومتر خوانده میشود که بسته به غلظت پروتئین، مقدار جذب اندازهگیری شده در این طول موج، متفاوت است. برای تعیین غلظت کمی پروتئین ها، ابتدا µl 100 از غلظت های مختلف BSA (g/mlµ20،40،60،80،100) تهیه شد و برای تهیه نمودار استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. سپس از نمونههای حاوی پروتئین مورد سنجش نیز به حجم نهایی 100 میکرولیتر، رقتهایی تهیه کرده و یک میلیلیتر از معرف برادفورد به هر کدام از نمونهها اضافه گردید. طی مدت زمان 5 تا 15 دقیقه پس از افزودن معرف برادفورد جذب آنها در 595 نانومتر خوانده شد. سپس جذب نوری به دست آمده برای پروتئین نامعلوم، بر اساس معادله خط به دست آمده از نمودار استاندارد، به غلظت پروتئینی تبدیل گردید.
3-3-4-2- سنجش کمی میزان پروتئین به روش جذب nm 280
در این روش با اندازه گیری میزان جذب نوری محلول پروتئین در طول موج nm 280 میزان پروتئین را تعیین می کنیم. این روش بر اساس میزان جذب نوری آمینواسید های آروماتیک مانند تیروزین طراحی شده است.
3-3-5- الکتروفورز ژل پلیآکریل آمید با SDS(SDS-PAGE)
این روش به طور معمول برای بررسی مراحل خالص سازی، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن مولکولی پروتئینها و پپتیدها بکار میرود. قابلیت تفکیککنندگی بسیار بالای روش SDS-PAGE عمدتاً ناشی از وجود SDS و ویژگی مناسب ژل پلیاکریل آمید در غربال پروتئینهای مختلف است. در این روش پروتئینها بر اساس اندازه از هم جدا میشوند. با جوشاندن نمونهها و گذاشتن آنها در شرایط احیا، این ملکولها خطی شده و SDS به آنها بار منفی میدهد، که میزان بار منفی بسته به طول آنها متفاوت خواهد بود. بنابراین پروتئینها به این صورت بر اساس اندازهشان در میدان الکتریکی ایجاد شده با سرعتهای متفاوتی حرکت کرده و از هم جدا میشوند. مراحل این نوع الکتروفورز بر اساس دستورالعمل ارائه شده در Qiagen Protocols و به شرح زیر انجام گردید:
3-3-5-1- آماده سازی محلولهای الکتروفورز
محلول استوک اکریل آمید (8/30 %): 30 گرم اکریل آمید و 8/0 گرم بیس اکریل آمید در حدود 50 میلیلیتر آب حل شد و سپس حجم نهایی آن به 100 میلیلیتر رسید. محلول در ظرف تیره نگهداری شد (این محلول تا 3 ماه در یخچال قابل استفاده است).
بافر ژل پایین (ژل جدا کننده): این بافر دارای غلظت 5/1 مولار تریس با 8/8~pH است. برای تهیه آن 2/18 گرم تریس- باز در حدود 70 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/8 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.
بافر ژل بالا (ژل متراکم کننده): این بافر دارای غلظت 5/0 مولار تریس با 8/6~pH است. برای تهیه آن 1/6 گرم تریس باز در حدود 50 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH آن با اسید کلریدریک 2 مولار تا 8/6 پایین آمد و حجم نهایی با آب مقطر به 100 میلیلیتر رسید.