تحقیق درمورد مهار فعالیت و فرآیندها

دانلود پایان نامه

به منظور بررسی پایداری دمایی ساختار آنزیم درمحیط مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون -PF6 در غلظت 100 % ، در دمای °C 85، به مدت 1 ساعت انکوبه گردید. در مقایسه بین دو طول مختلف زنجیره آلکیلی کاتیون، مایع یونی [C4MIM][PF6] با شدت نشر فلورسانس بیشتر نسبت به [C6MIM][PF6]، اثر پایدارکنندگی بیشتری را از خود نشان داد. در شکل 4- 12 مشاهده میشود که شدت نشر فلورسانس پس از 1 ساعت حرارتدهی به آنزیم در دمای °C 85، در محیط [C4MIM][PF6] در سطح 616 و در مورد [C6MIM][PF6] در سطح 332 قرار گرفته است. همچنین کاهش λMax در محیط [C6MIM][PF6] به میزان nm 5 دیده شد.
با بررسی طیف فلورسانس مربوط به TTL تیمار شده در مایع یونی [C4MIM][PF6] مقداری کاهش شدت نشر پس از 30 و 60 دقیقه دمادهی در °C85 میتوان دید (شکل 4-13). با این وجود تفاوت زیادی در نشر فلورسانس بین نمونههای حرارت دیده در مایع یونی و نمونه آنزیم غیرفعال وجود دارد که این امر گویای حفظ درصد بالایی از ساختار آنزیم در محیط [C4MIM][PF6] است.
شکل 4-12- طیفهای فلورسانس مربوط به آنزیم TTL انکوبه شده در مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون PF6؛
پس از 60 دقیقه حرارتدهی در دمای°C 85
شکل 4-13- طیف فلورسانس آنزیم TTL انکوبه شده در مایع یونی [C4MIM][PF6]؛
پس از حرارتدهی در دمای°C 85.
فصل پنجم
بحث
5-1- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
با به کارگیری مایعات یونی بر پایه ایمیدازولیوم در فرآیندهای بیوکاتالیزوری میتوان فعالیت، اختصاصیت و پایداری آنزیمها را ارتقا داد (Wehofsky et al.,2008، Debnath et al.,2010). مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون برمید حلالیت خوبی در آب دارند. کارهای متعددی در زمینه بررسی اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت آنزیم لیپاز در انجام واکنشهای استریفیکاسیون، ترانس استریفیکاسیون و تفکیک مخلوطهای راسمیک انجام شده است(Liu et al.,2010 ،Kaar et al., 2003 ،Lozano et al., 2004 ، Vidya and Chadha, 2009 ،Habulin and Knez,2009 ). با این وجود گزارشات محدودی از بررسی اثر مایعات یونی بر میزان فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز وجود دارد (Ventura et al., 2012 ، Na et al.,2013 ).
میتوان اثر غلظتهای مختلف و ساختار کاتیون مایع یونی بر فعالیت هیدرولازی TTL را بر اساس خصوصیات تفکیک یونی و تجمع مایعات یونی تفسیر کرد. با توجه به گزارش Na و همکاران با افزایش غلظت مایعات یونی [CnMIM][Br] رسانایی محلول نیز افزایش مییابد (Na et al.,2013). به گزارش Sirieix-Plenet و همکاران در غلظتهای کمتر از غلظت آستانه تشکیل میسل در مایع یونی، افزایش غلظت مایعات یونی با افزایش رسانایی محلول در ارتباط است و پس از این غلظت این رابطه دیده نمیشود (Sirieix-Plenet et al., 2004) پس بر اساس این مشاهدات میتوان غلظت آستانه تشکیل میسل را به دست آورد. غلظتهای آستانه تشکیل میسل و همچنین غلظتهای بهینه مایعات یونی برای فعالیت آنزیمی حاصل از پژوهش حاضر در جدول 5-1 آمده است. غلظتهای بهینه به دست آمده برای افزایش فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی در مورد [C2MIM][Br] و [C6MIM][Br] کمتر ازCMC های گزارش شده برای این مایعات یونی است و در مورد مایع یونی [C4MIM][Br] نیز غلظت بهینه در نزدیکی CMC مربوطه قرار دارد. بنابراین تا زمانی که غلظت مایعات یونی کمتر از مقادیر CMC مربوطه است، مایعات یونی میتوانند باعث افزایش فعالیت آنزیمی شوند. با افزایش غلظت مایع یونی از میزان CMC مربوطه مهار فعالیت آنزیمی را میتوان مشاهده کرد.
جدول 5-1- غلظتهای بهینه مایعات یونی (CnMIM Br n=2,4,6) و CMC های مربوطه
مایعات یونی
غلظت بهینه (mM)
CMC (mM)
[C2MIM][Br]
300
1900 (Goodchild I., 2007)
[C4MIM][Br]
1000
970 (Wang J. J., 2007)
[C6MIM][Br]
300
770 (Wang J. J., 2007)
مطالعات اندکی در رابطه با بررسی اثر تجمع مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی انجام شده است. در این رابطه میتوان مطالعهای توسط Geng را نام برد که ساختار پروتئین BSA را در کنار غلظتهای مختلف مایعات یونی مورد بررسی قرار داده است (Geng et al., 2010). نتایج نشان میدهد که در غلظتهای کمتر از CMC مایعات یونی برهمکنشهای الکتروستاتیک با BSA برقرار میکنند و باعث پایدار شدن ساختار دوم BSA میشوند. درحالیکه در غلظتهای بالاتر از CMC شدت آبگریزی مایعات یونی افزایش یافته و با اتصال قوی به BSA ساختار دوم آنرا برهم میزنند و باعث دناتوره شدن BSA میشوند. بنابراین میتوان گفت زمانی که غلظت مایع یونی بالاتر از CMC برود تعداد آنزیمهایی که درون میسلها به دام میافتند افزایش یافته و بنابر این آنزیمهای بیشتری غیرفعال خواهند شد. در رابطه با مایعات یونی که در این پژوهش مورد بررسی قرار گرفت، افزایش فعالیت هیدرولازی را میتوان بر اساس برهمکنشهای هیدروژنی و الکتروستاتیک ایجاد شده بین آنزیم و مایعات یونی آبدوست توضیح داد. این نوع برهمکنشها میتوانند باعث باز شدن نسبی جایگاه فعال آنزیم و در نتیجه دسترسی بیشتر سوبسترا به محل وقوع واکنش شوند. هرچند این مایعات یونی به دلیل اندازه بزرگ کاتیونها، فضای محدودی در اطراف آنزیم ایجاد میکنند که مانع از باز شدن کامل ساختار آنزیم میشوند. بنابراین در عین افزایش فعالیت آنزیمی در غلظت بهینه مایعات یونی آبدوست، پایداری ساختاری آنزیم نیز در این مایعات یونی حفظ میشود. نتایج نشان داد که کاهش فعالیت هیدرولازی TTL در غلظتهای بالاتری از مایعات یونی دارای زنجیره کوتاهتر کربنی مانند [C2MIM][Br] و [C4MIM][Br]، ایجاد میشود. در حالیکه در مورد مایعات یونی با زنجیره کربنی بلندتر مانند [C6MIM][Br]، این کاهش بلافاصله پس از گذشتن از غلظت بهینه اتفاق میافتد. کاتیونهای دارای زنجیره کربنی طویل میتوانند با ایجاد ممانعت فضایی در دهانه جایگاه فعال آنزیم که یک فضای آبگریز است، مانع از ورود سوبسترا و انجام واکنش شوند. این پدیده میتواند دلیلی برای کاهش فعالیت آنزیم در اثر افزایش غلظت مایعات یونی با طول زنجیرههای بلندتر باشد (Ventura et al., 2012).
شایان ذکر است که گزارشات موجود در مورد مایعات یونی دارای آنیون برمید غالبا اثر منفی این نوع از مایعات یونی را بر فعالیت و ساختار آنزیم نشان دادهاند. نوریتومی و همکاران درصد بسیار پائینی از فعالیت آنزیم لیزوزیم را در حضور مایع یونی [C2MIM][Br] نسبت به محیط بافری و مایعات یونی آبگریز گزارش دادند (Noritomi et al., 2011). ساسمال و همکاران [C5MIM][Br] را یک عامل دناتوره کننده برای پروتئین HSA دانستند (Sasmal et al., 2011). یان و همکاران تعداد زیاد برهمکنشهای الکتروستاتیک بین مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون برمید و آمینواسیدهای آسپارتات و گلوتامات پروتئین BSA را علت باز شدن ساختار BSA گزارش دادند (Yan et al., 2012). این در حالی است که در چنین مطالعاتی اثر غلظت مایعات یونی را بررسی نشده است. مطالعاتی توسط Na در سال 2013 و همچنین Zhao در سال 2006 از معدود مواردی هستند که این موضوع را مورد توجه قرار دادهاند. در این بخش از پژوهش نشان داده شد که مایعات یونی با آنیون برمید نیز میتوانند در غلظتهای خاصی اثرات مطلوب قابل توجهی بر فعالیت آنزیمی داشته باشند.
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL