تحقیق درمورد نگهداری و انتخاب

دانلود پایان نامه
بافر الکتروفورز: 5/1 گرم تریس- باز، 2/7 گرم گلیسین و 5/0 گرم SDS در 500 میلیلیتر آب مقطر حل شد. pH این بافر حدود 3/8 است.
APS 10%: 1/0 گرم APS در یک میلیلیتر آب مقطر حل شد (این محلول باید تازه تهیه شود).
TEMED 100%
بافر نمونه (4X): طبق جدول 3-5 تهیه گردید.
محلول رنگآمیزی: 05/0 گرم کوماسی آبی 250-R در 40 میلیلیتر متانول حل شد و محلول به مدت 1 ساعت در تاریکی روی استیرر بهم خورد. سپس 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 50 میلیلیتر آب مقطر به آن اضافه گردید. غلظت رنگ در این محلول 05/0% وزنی/ حجمی است. قبل از استفاده محلول رنگ با کاغذ واتمن صاف شد و در ظرف تیره نگهداری میشود.
محلول رنگبر: 15 میلیلیتر متانول، 10 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 75
میلیلیتر آب مقطر با هم مخلوط شدند (بالا بردن نسبت متانول رنگبری را تسریع میکند. با این حال باید توجه داشت که اگر ژل مدت طولانی در محلولهایی با درصد بالای متانول قرار گیرد، باندهای پروتئینی نیز بیرنگ میشوند).
3-3-5-2- آماده سازی سیستم الکتروفورز
یک قالب شیشهای به کمک صفحات شیشهای کاملاً تمیز و فاصلهاندازها که با توجه به ضخامت مورد نیاز ژل انتخاب شده اند، ایجاد شد و با چند گیره محکم گردید. به انتهای صفحات شیشهای به اندازه 2/0 سانتیمتر آگار مذاب 5/0% اضافه شد.
محلول ژل پایین (ژل جدا کننده): مقادیر مورد نیاز برای تهیه ژل با درصد مشخص در جدول 3-6 آورده شده است. پس از افزودن مواد، محلول را به سرعت بهم زده و با دقت در قالب شیشهای تا ارتفاع مناسبی ریخته شد، به طوریکه حدود 3 سانتیمتر فضا برای ژل بالا باقی ماند. سپس به آرامی از کناره شیشه روی سطح ژل اتانول اضافه گردید (این کار به منظور صاف شدن ژل و جلوگیری از چین خوردن در اثر خشک شدن به دلیل تماس هوا با آن است). انعقاد ژل پایین معمولاً 45-15 دقیقه طول میکشد.
محلول ژل بالا (ژل متراکم کننده) طبق جدول 3-6 تهیه شد ، بعد از انعقاد ژل پایین، اتانول روی ژل پایین کاملاً خالی شد و پس از تهیه محلول ژل بالا و هم زدن آن، سریعاً تا ارتفاع مناسب روی ژل پایین ریخته شد. سپس شانه در ژل بالا قرار گرفت، به صورتی که حدود 5/1 سانتیمتر از سطح ژل پایین فاصله داشت. انعقاد ژل بالا حدود 45-60 دقیقه طول میکشد.
پس از خارج ساختن فاصلهانداز پایین از حد فاصل شیشهها، قالب شیشهای با چند گیره به تانک الکتروفورز متصل گردید و مخازن بالا و پایین تانک با بافر الکتروفورز پر شد (به وسیلهی یک سرنگ حبابهای هوا در حد فاصل شیشهها خارج شد)، سپس شانه به آرامی خارج و درون چاهکها با تزریق بافر الکتروفورز تمیز گردید.
برای آماده سازی نمونههای پروتئینی، یک حجم بافر نمونه به 3 حجم نمونهی پروتئین حاوی 6 تا 20 میکروگرم پروتئین اضافه شد (بافر نمونه 4x) و به مدت 5 دقیقه در دمای ˚C 100 قرار داده شد. سپس حجم مناسبی از آن (حداکثر 40 میکرولیتر) به کمک سمپلر وارد چاهک شد.
کابلها به الکترودهای مربوطه وصل گردید. برای الکتروفورز در جریان الکتریکی ثابت، شدت جریان 30-20 میلیآمپر برای یک مینی ژل مناسب است. در صورت استفاده از ولتاژ ثابت، ولتاژ 150-100 ولت مناسب میباشد. جریان برق قبل از رسیدن رنگ نشانگر به انتهای ژل قطع شد (حدود 5/2-5/1 ساعت).
بعد از قطع جریان، قالب شیشهای از تانک جدا گردید و با فرو بردن یک فاصلهانداز به حد فاصل شیشهها و حرکت آرام آن، شیشهی بالا برداشته شد و سپس ژل درون یک ظرف مناسب قرار گرفت.
حجم کافی از محلول رنگ (100 میلیلیتر) به ژل اضافه شد.
محلول رنگ تخلیه و سپس ژل را شسته و حجم مناسبی از محلول رنگبر (100 میلیلیتر) به آن اضافه گردید. اگر زمینهی ژل تیره بود تا شفاف شدن آن از محلول رنگبر تازه استفاده میشد تا باندهای پروتئینی به وضوح دیده شوند.
ژل در محلول آبی 7% اسید استیک قرار داده شد که ژل در این حالت برای مدتهای طولانی قابل نگهداری است.
جدول 3-5- نحوه تهیه بافر نمونه 4X
ماده
مقدار
SDS
(mg) 750
تریس- HCl
(mg) 380
گلیسرول
(ml) 5/2