تحقیق درمورد پایداری و مناسبت

دانلود پایان نامه

مایعات یونی [C2MIM][Br]، [C4MIM][Br]، [C6MIM][Br]، [C12MIM][Br]، [C4MIM][PF6]، [C6MIM][PF6] بر اساس روش گفته شده در بخش 3-3-1، سنتز شدند. گرانروی این مایعات یونی با افزایش طول زنجیره افزایش مییابد و مایع یونی [C12MIM][Br] در دمای اتاق به صورت جامد است. مایعات یونی دارای آنیون PF6- به طور کلی گرانروی بیشتری نسبت به مایع یونی دارای آنیون Br- دارند.
4-4- اثر مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
در این بخش با افزودن مایع یونی با غلظتهای نهایی مشخص در مخلوط واکنش اثر طول زنجیره آلکیلی کاتیون ([CnMIM] n=2,4,6,12) و غلظتهای مایع یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم لیپاز TTL مورد بررسی قرار گرفت. تمامی آزمایشات دو بار تکرار شدند و به دلیل نزدیک بودن نتایج به هم، از اعداد به دست آمده از دو تکرار میانگین گرفته شد. در مایعات یونی مورد بررسی، مایعات یونی با زنجیرههای کوتاه آلکیلی اثر مطلوب بیشتری بر فعالیت آنزیمی داشتهاند و در زنجیرههای بلند کربنی کاهش فعالیت را میتوان دید.
همانطور که در نمودار نشان داده شده است(شکل 4-5)، با افزایش غلظت مایعات یونی در ابتدا افزایش فعالیت هیدرولازی TTL تا رسیدن به یک غلظت بهینه را میتوان دید و غلظتهای بالاتر از آن سبب کاهش فعالیت آنزیمی شدهاند. هرچند در رابطه با مایع یونی [C12MIM][Br] تنها اثر کاهشی بر فعالیت آنزیم دیده شد. بیشترین اثر افزایشی در فعالیت هیدرولازی TTL را میتوان به ترتیب در رابطه با مایعات یونی [C4MIM][Br]، [C2MIM][Br]، [C6MIM][Br] دید. بیشترین فعالیت نسبی آنها به ترتیب 254%، 177% و 135% بود که به ترتیب در غلظتهای 1000، 300 و 300 میلی مولار از مایع یونی به دست آمدند.
شکل 4-5- اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی
4-5- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL
4-5-1- پایداری دمایی TTL در عدم حضور مایعات یونی
با توجه به نمودار پایداری دمایی (شکل 4-6) آنزیم TTL در محیط بافری در دمای 75 درجه سانتیگراد پس از گذشت یک ساعت همچنان 90 درصد از فعالیت خود را حفظ میکند. اما در دمای 80 درجه سانتیگراد آنزیم با گذشت زمان به مرور پایداری خود را از دست میدهد. پس از گذشت یک ساعت حرارتدهی در دمای 80 درجه سانتیگراد 39 درصد از فعالیت باقی خواهد ماند. در دماهای بالاتر از 80، دمای 82 و °C 85، آنزیم کاملا ناپایدار بوده و پس از گذشت 15 دقیقه از حرارتدهی هیچ فعالیتی مشاهده نشد.
شکل 4-6- نمودار پایداری آنزیم TTL در دماهای بالا در بافر تریس mM 50 ، 8≈pH.
4-5-2- پایداری دمایی آنزیم TTL در حضور مایعات یونی
4-5-2-1- بررسی پایداری TTL در [C4MIM][Br] و ] [C4MIM][PF6 در دماهای مختلف
بررسی پایداری دمایی در مخلوط آبی [C4MIM][Br] با غلظت 1 مولار، در دمای °C 90 افت شدیدتری در پایداری آنزیم نسبت به دمای °C 85 را نشان میدهد. همانطور که در نمودار پایداری دمایی (شکل 4-7) میتوان دید، در دمای °C 85، در محیط [C4MIM][Br]، بیش از 90 درصد از فعالیت آنزیمی تا 30 دقیقه حفظ شده است و بعد از گذشت یک ساعت از حرارتدهی همچنان بیش از 60 درصد از فعالیت آنزیمی باقی میماند. آنزیم TTL در محیط [C4MIM][Br] در دمای °C 90، پس از گذشت 1 ساعت، 45 درصد از فعالیت خود را حفظ میکند. نتایج نشان میدهد که پایداری دمایی آنزیم در محیط [C4MIM][PF6] به شدت افزایش یافته است. آنزیم TTL در محیط [C4MIM][PF6] پس از 45 دقیقه حرارتدهی در دمای °C 85، همچنان 96 درصد از پایداری خود را حفظ کرده است. با افزایش دما به °C 90 توانایی مایع یونی [C4MIM][PF6] در حفظ پایداری آنزیم به همان شدت قبل است. همانطور که در نمودار B از شکل 4-7 مشاهده میشود، آنزیم TTL در مایع یونی [C4MIM][PF6] پس از گذشت 90 دقیقه حرارتدهی در °C 90 و °C 85، همچنان 72 درصد از فعالیت اولیه خود را حفظ میکند.
شکل4-7- نمودار پایداری TTL در [C4MIM][Br] و [C4MIM][PF6] در دماهای °C 85 و °C 90.
الف) محیط [C4MIM][Br] ب) محیط [C4MIM][PF6].
4-5-2-2- مقایسه اثر نوع آنیون مایعات یونی بر پایداری دمایی
مایعات یونی ایمیدازولیومی بسته به نوع آنیونی که در ساختار خود دارند، شدت اثر پایدارکنندگی متفاوتی را از خود نشان میدهند. برای مثال در مقایسهای بین مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][Br] در دماهای بالا (°C85 و °C90) اثر پایدارکننده بیشتری در مورد مایع یونی دارای آنیون -PF6 میتوان دید (شکل4-8).در دمای °C85 ، 96 درصد از آنزیمها در محیط [C4MIM][PF6] پس از 45 دقیقه حرارت دهی پایدار ماندهاند و پس از آن شیب ملایمی از کاهش پایداری TTL مشاهده میشود و پس از 90 دقیقه همچنان 70 درصد از آنزیمها پایداری خود را حفظ کردهاند. در حالیکه پایداری آنزیم در محیط [C4MIM][Br] طی حرارتدهی در °C85، با سرعت بیشتری کاهش یافت و در پایان 90 دقیقه حرارتدهی، 41 درصد از فعالیت اولیه آنزیمی مشاهده شد. با افزایش دما به °C 90 حفظ پایداری آنزیم در محیط [C4MIM][PF6] با همان روند قبل دیده میشود، در حالیکه در محیط [C4MIM][Br] روند کاهشی شدیدتری در پایداری آنزیم مشاهده میشود. پس از 60 دقیقه حرارتدهی در °C 90 پایداری به 45 درصد میزان اولیه رسیده است و پس از 90 دقیقه تنها 32 درصد از آنزیمها پایدار ماندهاند.
4-5-2-3- مقایسه اثر نوع کاتیون و طولهای مختلف زنجیره کربنی مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم
پایداری دمایی آنزیم TTL در مایعات یونی ایمیدازولیومی با طولهای مختلف زنجیره کربنی مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل4-9 مشاهده میشود مایعات یونی با زنجیرههای 2، 4 و 6 کربنه عملکرد نسبتا مشابهی را در حفظ پایداری آنزیم از خود نشان میدهند. در این میان [C6MIM][Br] با اختلاف کمی نسبت به [C2MIM][Br] و [C4MIM][Br]، محیط مناسبتری را برای حفظ پایداری آنزیم فراهم میکند. در مورد این 3 مایع یونی پس از گذشت 1 ساعت دمادهی در °C85 بیش از 50 درصد از فعالیت آنزیم همچنان باقی مانده است. همچنین مایعات یونی با زنجیره 12 کربنه هیچ گونه اثر مطلوبی بر پایداری آنزیم نشان نداده است.
همانطور که در شکل 4-10 نشان داده شده است، دو نوع مختلف کاتیون از پایه ایمیدازولیوم و پایه پیریدینیوم تفاوت چندانی در میزان پایداری آنزیم ایجاد نمیکنند. اثر پایدارکننده مشابهی در مورد مایع یونی [C5Py][Br] و مایعات یونی [C4MIM][Br] و [C6MIM][Br] دیده شد. در رابظه با مایع یونی [C12Py][Br] نیز مانند [C12MIM][Br] هیچ اثر مطلوبی بر پایداری دمایی آنزیم مشاهده نشد.
شکل4-8- نمودار پایداری دمایی TTL در مایعات یونی؛ مقایسه اثر نوع آنیون.
A) دمای °C85 B) دمای °C90
شکل 4-9- نمودار مقایسه اثر مایعات یونی با طولهای مختلف زنجیره کربنی کاتیون ایمیدازولیوم
بر پایداری دمایی آنزیم
شکل 4-10- نمودار بررسی اثر نوع کاتیون بر پایداری دمایی آنزیم TTL.
4-6- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور و عدم حضور مایعات یونی
در این بخش از پژوهش ابتدا پایداری ساختاری آنزیم در بافر تریس در دمای °C 85 مورد بررسی قرار گرفت. شکل 4-11 طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 (pH = 8) را در زمانهای مختلف حرارتدهی در °C 85 (0، 30 و 60 دقیقه) نشان میدهد. بیشینه نشر فلورسانس در مورد آنزیم TTL قبل از حرارتدهی 570 و در λMax 333 نانومتر است. پس از حرارتدهی شدت نشر فلورسانس به شدت کاهش یافته، به طوری که در زمان 30 دقیقه بیشینه نشر به 385 ودر زمان 60 دقیقه به 368 کاهش یافته است.
شکل 4-11- طیف فلورسانس آنزیم TTL در بافر تریس mM 50 پس از حرارتدهی در °C 85