مقاله با موضوع بهینه سازی و صنعت دارو

دانلود پایان نامه

اثر آنیونها بر اساس این سری بیشتر از کاتیونها است. در پژوهشی توسط Kumar مایعات یونی دارای آنیون کاسموتروپ و کاتیون کائوتروپ بر اساس سری هافمیستر گزینه های مناسبی برای پایدار ماندن آنزیمها پیشنهاد شدند (Kumar et al. 2014). هرچند سری هافمیستر در برخی موارد صدق نمیکند. برای مثال در مورد آنیون PF6- گزارشات مختلفی مبنی بر افزایش پایداری آنزیمها در مایعات یونی دارای این آنیون وجود دارد. از این جمله میتوان پژوهش Ha و همکاران را نام برد که پایداری دمایی بسیار خوبی از آنزیم CALB را در حضور مایعات یونی با آنیون PF6- دیدند (Ha et al., 2008). این در حالی است که جایگاه این آنیون در سری هافمیستر در دسته آنیونهای کائوتروپ و ناپایدارکننده است. در تفسیر چگونگی اثر این آنیون بر پایداری آنزیم، Klahn با بررسی حلالیت آنزیم CALB در 8 نوع مایع یونی مختلف، علت پایداری بیشتر آنزیم در مایعات یونی دارای آنیون PF6- را آبگریزی بالای این آنیون دانست (Klahn et al., 2011). آنیونهای آبگریز مانند PF6- با آنزیم پیوند هیدروژنی برقرار نمیکنند و ملکولهای آب ضروری اطراف آنزیم را حفظ میکنند. بنابراین آسیبی به ساختار طبیعی آنزیم نمیزنند. همچنین در بین آنیونها، آنیونهایی با اندازه کوچکتر و چگالی بار سطحی بیشتر، به تعداد بیشتری در سظح آنزیم تجمع مییابند و بر همکنشهای الکتروستاتیک قویتری با بارهای سطحی آنزیم برقرار میکنند. در این حالت احتمال باز شدن ساختار طبیعی آنزیم به دلیل تعداد بیشتر برهمکنشها با حلال افزایش مییابد. چنین پدیدهای را در مورد مایعات یونی دارای آنیون برمید یا کلرید میتوان دید. به طور متقابل آنیونهای بزرگی مانند PF6- که چگالی بار سطحی کمی دارند، توانایی ایجاد تعداد کمتری برهمکنش الکتروستاتیک با سطح آنزیم دارند. بنابراین کمتر ساختار آنزیم را تحت تاثیر قرار میدهند. با این حال حفظ پایداری آنزیم در چنین محیطهایی همواره با مشکل حل نشدن آنزیم در مایعات یونی آبگریز همراه بوده است (Klahn et al., 2011). حفظ پایداری آنزیم در مایع یونی [C4MIM][PF6] در دماهای بالا پیش از این نیز گزارش شده است (Ha et al., 2008) که با نتایج گزارش شده از پژوهش حاضر مطابقت دارد.
بر اساس نتایج حاصل از بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در مایعات یونی ایمیدازولیومی با طولهای مختلف زنجیره کربنی، مایعات یونی با زنجیرههای 2، 4 و 6 کربنه عملکرد نسبتا مشابهی را در حفظ پایداری آنزیم از خود نشان میدهند. اختلاف زیاد فعالیت باقیمانده آنزیم پس از دمادهی در محیط مایعات یونی نسبت به محیط بافری نشان دهنده اثر بسیار مطلوب مایعات یونی در حفظ پایداری آنزیم است که دلایل احتمالی این اثر پیش از این گفته شد. در این میان [C6MIM][Br] با اختلاف کمی نسبت به [C2MIM][Br] و [C4MIM][Br]، محیط مناسبتری را برای حفظ پایداری آنزیم فراهم میکند.
با مقایسه پایداری آنزیم در این مایعات یونی میتوان دریافت که طول زنجیره کاتیونی اثر کمی در میزان اختلاف پایداری آنزیم در این محیطها دارد. هرچند طولهای بسیار بالای زنجیره کاتیونی مایعات یونی ایمیدازولیومی اثر منفی بر پایداری ساختار آنزیم میگذارند. مایعات یونی که در کاتیون خود زنجیره آلکیلی بلند دارند، در محیط آبی مانند سورفاکتانت عمل میکنند و بر فعالیت و پایداری آنزیم به شدت اثر میگذارند (Greaves et al., 2008, Tariq et al., 2012). گزارشات متعددی مبنی بر اثر طول زنجیره مایعات یونی بر پایداری و فعالیت آنزیمها وجود دارد. Attri و همکاران دریافتند که مایعات یونی با کاتیون ایمیدازولیوم و فسفونیوم هرچقدر زنجیره آلکیل بلندتر و در نتیجه آبگریزی بیشتری داشته باشند عامل پایدارکننده ضعیفتری برای α-کیموتریپسین به حساب میآیند (Attri et al., 2011).
همانطور که در بخش 4-6-2-3 نشان داده شد، با تغییر نوع کاتیون از پایه ایمیدازولیوم به پایه پیریدینیوم تغییر زیادی در میزان پایداری دیده نمیشود. مایع یونی [C5Py][Br] نیز مانند مایعات یونی ایمیدازولیومی با طول مشابه ([C4MIM][Br] و [C6MIM][Br]) باعث حفط پایداری آنزیم در حدود 60 درصد طی یک ساعت دمادهی در دمای °C85 میشود. همچنین مایع یونی [C12Py][Br] به طور مشابهی نسبت به مایع یونی متناظر ایمیدازولیومی ([C12MIM][Br]) هیچ اثر مطلوبی بر پایداری دمایی آنزیم نداشته است. در این مورد Yamamoto و همکاران مشاهده کردند که افزایش طول زنجیره کربنی در مایع یونی [CnPy][Br] باعث ناپایدار شدن آنزیم لیزوزیم میشود (Yamamoto et al., 2011). علت احتمالی این پدیده ایجاد برهمکنشهای آبگریز قوی بین آنزیم و زنجیره بزرگ کاتیونی آبگریز مایع یونی گزارش شده است.
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی
اسپکتروسکوپی فلورسانس یک ابزار مرسوم برای بررسی تغییرات کنفورماسیون پروتئین است. در این بخش از پژوهش جهت ایجاد درک بهتر از مکانیسم پایدارسازی آنزیم توسط مایعات یونی از تکنیک فلورسانس جهت بررسی ساختار آنزیم TTL، پس از مجاورت با مایعات یونی مختلف در دمای °C85 و سرد سازی در یخ، استفاده شد.
آنزیم TTL داری دو آمینواسید تریپتوفان در ساختار خود میباشد که در این روش میزان نشر فلورسانس این آمینواسید پس از برانگیخته شدن در طول موج nm 295، مورد بررسی قرار گرفت. بیشینه میزان شدت فلورسانس (IMax) و بیشینه طول موج نشر (λMax)، تغییرات کنفورماسیون آنزیم را در حضور مایعات یونی مختلف و در عدم حضور مایع یونی نشان میدهد (Bekhouche M., 2012). زمانی که ساختار آنزیم باز شود این باقیماندههای کروموفور در معرض حلال آبدوست قرار میگیرند و در نتیجه شدت نشر فلورسانس آنها با قرارگیری در فضای آبدوست کاهش مییابد. البته این امر میتواند به دلیل پوشانده شدن عوامل فلوروفور پروتئین (Trp) توسط یونهای مایع یونی نیز باشد.
کاهش شدید نشر فلورسانس پروتئین به سبب باز شدن ساختار دوم پروتئین و قرارگیری باقیمانده های Trp در معرض حلال آبدوست مشاهده میشود. چنین پدیده ای در اثر حرارت دهی به آنزیم TTL در محیط بافری دیده شد. همانطور که در بخش 4-6-2 این پژوهش نیز نشان داده شد، آنزیم TTL در فضای بافری در دمای ˚C 85 پایدار نیست و در اثر حرارت دهی ساختار آنزیم باز شده و با قرارگیری باقیمانده های Trp در معرض حلال آبدوست، کاهش نشر فلورسانس را سبب خواهد شد.
طیف های نشری فلورسانس آنزیم TTL پس از انکوباسیون آنزیم در مایعات یونی[C4MIM][PF6] و [C6MIM][PF6] و سپس خارج کردن آنزیم از این محیط و وارد کردن آن به فضای آبی، گرفته شدند. بالا بودن شدت نشر فلورسانس در مورد آنزیم انکوبه شده در [C4MIM][PF6] نشان دهنده حفظ فشردگی ساختاری TTL در این محیط، حتی پس از 1 ساعت حرارت دهی در ˚C 85 است. شدت نشر فلورسانس مربوط به [C6MIM][PF6] پایینتر از [C4MIM][PF6] است. هرچند، کاهش λMax در مورد محیط [C6MIM][PF6] را می توان به فشردهتر شدن ساختار پروتئین در این محیط که آبگریزتر و دارای گرانروی بالاتری نسبت به [C4MIM][PF6] است، مرتبط دانست.
بنابراین با توجه به مشاهدات ساختاری بر اساس طیف های فلورسانس و بررسی های سینتیکی فعالیت آنزیمی در حضور این مایعات یونی می توان گفت آنزیم TTL در محیط [C4MIM][PF6] پایداری دمایی بیشتری هم از نظر ساختاری و هم از نظر حفظ فعالیت سینتیکی را داشته است.
بررسی ساختار TTL در محیط [C4MIM][PF6] در زمان های مختلف حرارت دهی نشان میدهد که آنزیم تا حد زیادی ساختار خود را حفظ کرده است. کاهش اندک نشر فلورسانس پس از 30 و 60 دقیقه حرارت دهی در ˚C 85 گویای حفظ باقیمانده های Trp در جایگاه درون ساختاری خود میباشند. همچنین تفاوت زیاد موجود در بیشینه نشر فلورسانس مربوط به آنزیم حرارت داده شده در ˚C 85، نسبت به آنزیم کاملا غیرفعال (2 ساعت حرارت دهی در ˚C100 در بافر تریس mM 50)، بیانگر حفظ پیچیدگی ساختاری در محیط این مایع یونی است. علت این امر همانطور که پیش از این نیز در بخش سینتیکی گفته شد آبگریزی بالای مایع یونی است که سبب حفظ آب ضروری اطراف آنزیم می شود. همچنین بزرگی ملکولهای این نوع مایعات یونی سبب تشکیل ساختارهای شبکه مانندی می شود که انعطافپذیری ملکول آنزیم را کم کرده و در هنگام افزایش دمای محیط مانع از باز شدن ساختار آنزیم و دناتوره شدن پروتئین میشود.
فصل ششم
نتیجه گیری و پیشنهادات
6-1- نتیجه گیری
به منظور بررسی اثر مایعات یونی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم TTL، 10 نوع مایع یونی برای تیمار آنزیم TTL مورد استفاده قرار گرفتند. در محدوده غلظتی خاصی، افزایش فعالیت هیدرولازی TTL در حضور مایعات یونی [CnMIM][Br] دیده شد. غلظت بهینه با اثر مثبت بر فعالیت هیدرولازی آنزیم، در مورد تمام مایعات یونی کمتر از CMC بود و با افزایش طول زنجیره کربنی کاتیون این غلظت کاهش یافت. آنزیم TTL در مایعات یونی دارای کاتیونها با زنجیرههای متوسط آلکیلی ([C4MIM][Br]، [C6MIM][Br] و [C5Py][Br]) پایداری دمایی بالایی را در °C 85 از خود نشان داد. در مقایسه بین دو نوع آنیون، آنزیم TTL در مایع یونی دارای آنیون آبگریز PF6- پایدارتر بود. بررسی طیفهای فلورسانس مربوط به این نمونهها نیز حفظ پایداری TTL در مایعات یونی ذکر شده را نشان داد. بنابر نتایج حاصل از این پژوهش، آنیونهای آبگریز و کاتیونهایی با طول زنجیره آلکیلی متوسط، گزینههای خوبی برای طراحی مایعات یونی مناسب جهت استفاده به عنوان حلال در واکنشهای کاتالیز شده توسط آنزیم TTL هستند.
6-2- پیشنهادات
بهینه سازی محیط انجام واکنش تفکیک مخلوطهای راسمیک از نظر غلظت مایعات یونی مختلف، pH محیط و دمای انجام واکنش با هدف کاربرد TTL در صنعت داروسازی
تثبیت آنزیم TTL روی نانوذرات مغناطیسی جهت تسهیل کاربرد آنزیم در صنعت
به کارگیریscCO2 به همراه مایعات یونی نامحلول در آب به عنوان محیط انجام واکنش