مقاله درمورد دانلود اندازه گیری و بهینه سازی

دانلود پایان نامه

3-3-2-5-2- انتخاب بهترین زمان پس از القا
برای بهینه سازی بیان یک پروتئین نوترکیب پیشنهاد شده است که یک آنالیز زمانی با SDS-PAGE برای تشخیص سطح بیان پروتئین در زمانهای مختلف پس از القا انجام گیرد. محتوای پروتئین درون سلولی به طور معمول دارای یک تعادل بین میزان پروتئینهای محلول درون سلول و میزان پروتئینهای موجود دراجسام نامحلول و پروتئینهای در حال خراب شدن است. با بررسی میزان پروتئین موجود در عصاره سلولی در زمانهای مختلف پس از القا، میتوان مدت زمان پس از القا را یافت.
ابتدا از کشت یک شبه باکتری در محیط LB جدید به همراه آمپیسیلین، 1% تلقیح انجام شد و به مدت 4 ساعت در دمای °C 37 با rpm 200 به باکتریها اجازه رشد و تکثیر داده شد. زمانی که کدورت محیط در طول موج nm 600 به 9/0 رسید، ابتدا ml1 از باکتریها به عنوان نمونه القا نشده برداشته شد و پس از سانتریفوژ rpm 5000 به مدت 5 دقیقه، رسوب سلولی در μl 50 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-5) حل شد. سپس القای بیان پروتئین با IPTG با غلظت نهایی mM انجام شد. محیط کشت در دمای °C 30 قرار داده شد. پس از گذشت زمان 4، 5، 6 و24 ساعت از القا، ml 1 از محیط کشت نمونهبرداری شد و پس از سانتریفوژ رسوب سلولی در μl 100 بافر نمونه SDS-PAGE با غلظت X1 (جدول 3-6) حل شد. نمونهها تا زمان انجام SDS-PAGE در 20- نگهداری شد.
3-3-2-6- استخراج عصاره سلولی حاوی لیپاز TTL
سلول های فریز شده با قرار گرفتن در دمای اتاق ذوب شدند و سپس به مدت 2 تا 3 ساعت در حضور آنزیم لیزوزیم با غلظت نهایی mg/ml 1/0 انکوبه شدند. آنگاه هر ml 5 از محلول باکتریها با استفاده از دستگاه سانیکاتور با شدت % 60 در مراحل 30 ثانیه ای با رعایت فواصل زمانی 1 دقیقه ای که محلول در یخ قرار داده می شد، در مجموع به مدت 4 دقیقه سانیکیت شدند. سپس پروتئین های دناتوره شده، غشاهای سلولی و سایر عوامل نامحلول به کمک سانتریفوژ با دور rpm 8500 به مدت 10 دقیقه جدا سازی شدند و محلول رویی به عنوان مخلوط پروتئینی حاوی آنزیم لیپاز مورد استفاده قرار گرفت.
3-3-3- روش تخلیص آنزیم لیپاز TTL
3-3-3-1- روش رسوب دهی دمایی
در مرحله اول تخلیص، با توجه به مقاومت دمایی آنزیم TTL، رسوب دهی دمایی مخلوط پروتئینی در دمای °C 65 در بن ماری به مدت 40 دقیقه و بلافاصله یخ گذاری به مدت 30 دقیقه به منظور حذف پروتئین های غیر مقاوم به دما انجام گردید. سپس با سانتریفوژ دور rpm 13000 پروتئینهای دناتوره شده رسوب داده شدند و محلول رویی به عنوان نمونه پروتئینی با خلوص نسبی مورد استفاده قرار گرفت. مقداری از آنزیم نیز جهت استفاده به صورت پودر خشک به کمک دستگاه فریزدرایر لیوفیلیز شد.
3-3-3-1-1- بهینه سازی رسوب دهی دمایی
جهت انتخاب بهترین زمان حرارتدهی برای رسیدن به بیشترین خلوص ممکن و ایجاد کمترین آسیب به آنزیمهای TTL موجود در مخلوط پروتئینی، عصاره سلولی باکتری حاوی پروتئین نوترکیب (TTL)، به 6 بخش تقسیم شد و هر کدام به مدت زمان مشخصی (30، 40، 50، 60، 70 و 80 دقیقه) در دمای °C 65 قرار داده شد. پس از یخگذاری نمونهها، پروتئینهای دناتوره شده به کمک سانتریفوژ جدا شدند و μg 12 از پروتئینهای مقاوم به حرارتدهی باقیمانده در محلول مربوط به 6 نمونه، به همراه بافر نمونه حاوی رنگ، وارد چاهکهای SDS-PAGE شد(بخش 3-3-5) و بهینه مدت زمان رسوبدهی دمایی مشخص گردید.
3-3-3-2- روش تخلیص به کمک ستون کروماتوگرافی
در این مرحله از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی Q- سفاروز با شیب نمکی سدیم کلرید در محدوده 0 تا 5/0 مولار در pH 8 بافر تریس استفاده شد. پس از تشخیص غلظت بهینه نمک برای جداسازی آنزیم TTL(حدود غلظت 15/0)، به صورت مرحلهای و طی 3 مرحله غلظتی از نمک سدیم کلرید (مرحله اول: غلظت 0، مرحله دوم: غلظت 1/0 مولار، مرحله سوم: غلظت 15/0 مولار) آنزیم TTL از سایر پروتئینهای مخلوط پروتئینی جدا گردید.
3-3-4- روش سنجش کمی پروتئین
در این پژوهش از دو روش مختلف جهت اندازه گیری کمی میزان پروتئین استفاده شد:
3-3-4-1- سنجش کمی میزان پروتئین به روش برادفورد
محلول برادفورد طبق جدول 3-5 تهیه گردید. ابتدا پودر کوماسی بلو به مدت 1 تا 2 ساعت در تاریکی با اتانول بر روی استیرر حل میکنیم. در ادامه اسید فسفریک را به آن افزوده و حجم آن را با آب مقطر به 1000 میلیلیتر میرسانیم. سپس محلول برادفورد تهیه شده را با کاغذ واتمن فیلتر کرده و در ظرف تیره نگهداری میکنیم.
جدول 3-5- نحوه تهیه محلول برادفورد
مواد مورد نیاز
مقدار
Comassie Brilliant Blue G-250
1/0 گرم
اتانول 95%