مقاله درمورد دانلود بهینه سازی و مشاهده

دانلود پایان نامه

آنزیم لیپاز مقاوم به دما (TTL) توسط باکتری ترموانروباکتر ترموهیدروسولفوریکوس نوعی آرکئاباکتر گرمادوست ترشح میشود. این باکتری از یک دریاچه آب گرم در آلمان جداسازی شده است. ژن آنزیم TTL توسط رویتر از ژنوم باکتری جداسازی و وارد وکتور بیانی PQE- 80L شد (Royter M., 2006) (شکل 4-1). وکتور حاوی ژن TTL هدیهای از طرف گروه تحقیقاتی در TUHH بود که در این پژوهش به درون باکتری E.coli BL21 منتقل شد و بیان آن مورد بررسی قرار گرفت.
شکل 4-1- وکتور PQE-80L حاوی ژن آنزیم TTL.
4-1-1- انتخاب بهترین کلنی از نظر بیان آنزیم TTL
کلنیهای 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون، ابتدا کشت یک شبه و سپس کشت 1% تلقیح در محیط LB حاوی آمپیسیلین μg/ml 100 داده شدند. القای بیان پروتئین به کمک IPTG با غلظت mM 1 به مدت 6 ساعت انجام شد. سلولهای باکتری بیان کننده پروتئین نوترکیب به کمک سانتریفوژ جمعآوری شده و با غلظت 10 برابر در بافر تریس حل شدند. در مرحله بعد ابتدا با فریز و ذوب کردن سلولها و سپس به کمک آنزیم لیزوزیم و استفاده از امواج صوتی، دیواره سلولی و غشای باکتریها تخریب شدند. سپس پروتئینهای دناتوره شده و قطعات دیوارههای سلولی تخریب شده، به کمک سانتریفوژ رسوب داده شدند. عصاره سلولی حاوی آنزیم TTL جمعآوری شد و میزان فعالیت آنزیم موجود در آن مورد بررسی قرار گرفت. جدول 4-1 میزان فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL در عصارههای سلولی کلنیهای حاصل از ترانسفورماسیون را نشان میدهد. کمترین فعالیت آنزیمی دیده شده مربوط به کلنی شماره 4 به میزان U/ml 040/0 است و بیشترین فعالیت لیپازی در مورد کلنیهای 3 و 6 با مقادیر 106/0 و 093/0 U/ml دیده شد. هر چند با بررسی غلظتهای پروتئینی و محاسبه فعالیت ویژه (Unit/mg Protein) آنزیم موجود در مخلوط پروتئین، مشاهده شد که کلنی 6 فعالیت ویژه بیشتری نسبت به کلنی 3 دارد. بنابراین کلنی شماره 6 به عنوان بهترین کلنی تولید کننده TTL انتخاب شد.
4-1-2- بهینه سازی زمان پس از القا توسط IPTG با غلظت mM 1
جهت بررسی میزان بیان پروتئین در ساعتهای مختلف پس از القا، 1 میلی لیتر از محیط باکتری در زمانهای مشخص رسوب داده شد و در بافر SDS-PAGE حل شد. سپس μl 30 از هر کدام از نمونههای سلولی به درون چاهکهای SDS-PAGE وارد شد. بیان پروتئین نوترکیب در زمان 4 ساعت پس از القا کم و پس از 5 ساعت افزایش نشان داد. در زمان 6 ساعت بالاترین بیان پروتئین مشاهده شد و پس از گذشت 24 ساعت تغییری در میزان بیان پروتئین نوترکیب دیده نشد. بنابراین زمان 6 ساعت به عنوان بهترین زمان برداشت سلولها پس از القا انتخاب شد.
جدول 4-1- فعالیتهای لیپازی عصارههای سلولی کلنیهای 1 تا 6 حاصل از ترانسفورماسیون
شماره کلنی
تعداد واحد آنزیم در میلیلیتر (U/ml)
غلظت پروتئین (mg/ml)
Unit/mg Protein
1
079/0
78/1
044/0
2
066/0
42/2
027/0
3
106/0
03/2