مقاله درمورد دانلود حالت طبیعی و بهینه سازی

دانلود پایان نامه

سوبسترا پارانیتروفنیل پالمیتات*
40
آنزیم
30
بافر تریس* با ترایتون 100-X
330
حجم نهایی
400
* غلظت سوبسترای pNPP : 10 میلی مولار
* بافر تریس دارای غلظت 50 میلی مولار بوده و ترایتون 100-X با غلظت نهایی 1% در بافر وجود دارد.
3-3-7- روش بررسی فعالیت آنزیمی در حضور غلظت های مختلف از انواع مایعات یونی
در این بخش از پژوهش مخلوط بافر، سوبسترا و مایع یونی با غلظتهای نهایی مختلفی از مایعات یونی (بین صفر تا 5/1 مولار) [C2MIM][Br]، [C4MIM][Br]، [C6MIM][Br]، [C12MIM][Br] ایجاد شد. با افزودن آنزیم لیپاز به مخلوط ایجاد شده، اثر حضور غلظت های مختلف مایع یونی بر فعالیت آنزیم لیپاز بر اساس روش سنجش گفته شده در بخش 3-3-5 مورد بررسی قرار گرفت. در ضمن برای بدست آوردن فعالیت خالص آنزیمی، میزان هیدرولیز pNPP در حضور غلظت های مختلف مایعات یونی از میزان فعالیت بدست آمده کسر شد.
3-3-8- روش بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در دماهای بالا
به منظور بررسی میزان پایداری دمایی لیپاز TTL ، 0052/0 گرم پودر آنزیم لیوفیلیز شده (دارای غلظت پروتئینی معادل mg/ml 307/0) به μl 600 بافر تریس mM 50 اضافه شد. سپس با انجام ورتکس ملایم آنزیم در بافر حل شد. 4 محلول آنزیمی به همین روش ایجاد شد. محلولهای به دست آمده در دماهای°C 75 ، °C 80 ، °C 82 و °C 85 در لولههای اپندورف 5/1 میلی لیتری در دستگاه هات بلاک انکوبه گردید. در زمانهای 0، 15، 30، 45 و 60 دقیقه مقداری از هر کدام از نمونههای انکوبه شده برداشته و به مدت 30 دقیقه در یخ قرار داده شد. با بررسی فعالیت آنزیمهای انکوبه شده در دماها و زمانهای مختلف پایداری دمایی آنزیم مورد بررسی قرار گرفت.
3-3-9- روش بررسی پایداری آنزیم لیپاز TTL در حضور مایعات یونی مختلف
در این پژوهش به منظور بررسی میزان پایداری لیپاز TTL در مایعات یونی، 0052/0 گرم پودر آنزیم لیوفیلیز شده (دارای غلظت پروتئینی معادل mg/ml 307/0) به μl 600 محلول آبی مایعات یونی (دارای آنیون برمید)، با غلظت M 1 ، و یا μl 600 از مایعات یونی نامحلول در آب (دارای آنیون هگزافلوروفسفات) اضافه شد. سپس با انجام ورتکس ملایم آنزیم در مایع یونی محلول یا معلق گردید. مخلوطهای به دست آمده در دماهای °C 85 و °C 90 در لولههای اپندورف در دستگاه هات بلاک انکوبه گردید. در زمانهای 0، 15، 30، 45، 60 و 90 دقیقه مقداری از هر کدام از نمونههای انکوبه شده برداشته و به مدت 30 دقیقه در یخ قرار داده شد. با بررسی فعالیت آنزیمهای انکوبه شده در دماها، زمانها و مایعات یونی مختلف میزان اثر مایع یونی بر پایداری دمایی آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. فعالیتهای خالص آنزیمی پس از حرارتدهی آنزیم در حضور مایعات یونی، با کسر فعالیتهای به دست آمده از میزان پایه هیدرولیز pNPP توسط هرکدام از مایعات یونی دارای آنیون برمید، به دست آمد. پایداری دمایی یک نمونه کنترل از آنزیم در عدم حضور مایعات یونی (در بافر تریس mM 50) نیز به همین روش مورد بررسی قرار گرفت. لازم به ذکر است که در رابطه با مایعات یونی نامحلول در آب پس از اتمام زمان یخگذاری مخلوط مایع یونی حاوی آنزیم با حجم مساوی از بافر شسته شد و پس از سانتریفوژ ملایم محلول رویی حاوی آنزیم مورد سنجش فعالیت آنزیمی قرار گرفت.
3-3-10- روش بررسی ساختار سوم آنزیم TTL در حضور مایعات یونی
اسپکتروسکوپی فلورسانس ذاتی پروتئین در حضور و عدم حضور مایعات یونی مختلف، جهت درک بهتر فرآیند باز شدن ساختار پروتئین انجام شد. آنزیم TTL خالص با غلظت نهایی μM 1/0 به مایعات یونی اضافه شد. مایعات یونی نامحلول در آب به صورت خالص استفاده شدند. مخلوط آنزیم با مایع یونی پس از ورتکس ملایم به صورت امولسیون در آمده و در لولههای اپندورف درون چاهکهای دستگاه هات بلاک در دمای °C 85 قرار گرفتند. مایعات یونی محلول در آب (دارای آنیون برمید) با غلظت نهایی 1 مولار (رقیقسازی با بافر تریس 50 میلی مولار) مورد استفاده قرار گرفتند. یک نمونه کنترل از آنزیم در عدم حضور مایعات یونی نیز دمادهی شد و طیف فلورسانس مربوط به آن ثبت گردید. در رابطه با مایعات یونی نامحلول در آب، برای جداسازی پروتئین از فضای مایع یونی، با حفظ غلظت نهایی آنزیم در μM 1/0، شستشو با بافر تریس 50 میلی مولار انجام شد.
نمونههای پروتئینی در nm 295 برانگیخته شدند و طیفهای نشر فلورسانس بین nm 310 تا nm 500 ثبت گردید. شکاف برانگیختگی و نشر فلورسانس هر دو nm 10 تنظیم شدند. پس از گذشت زمانهای دمادهی مورد نظر (0، 30، 60 دقیقه) نمونهها در یخ سرد شدند تا در صورت برگشتپذیر بودن دناتوراسیون پروتئینها به حالت طبیعی برگردند و سپس طیف فلورسانس آنها مورد بررسی قرار گرفت.
فصل چهارم
نتایج
4-1- بهینه سازی بیان آنزیم نوترکیب