مقاله درمورد دانلود شرایط محیطی و بهینه سازی

دانلود پایان نامه

مطالعات اندکی در رابطه با بررسی اثر تجمع مایعات یونی بر فعالیت آنزیمی انجام شده است. در این رابطه میتوان مطالعهای توسط Geng را نام برد که ساختار پروتئین BSA را در کنار غلظتهای مختلف مایعات یونی مورد بررسی قرار داده است (Geng et al., 2010). نتایج نشان میدهد که در غلظتهای کمتر از CMC مایعات یونی برهمکنشهای الکتروستاتیک با BSA برقرار میکنند و باعث پایدار شدن ساختار دوم BSA میشوند. درحالیکه در غلظتهای بالاتر از CMC شدت آبگریزی مایعات یونی افزایش یافته و با اتصال قوی به BSA ساختار دوم آنرا برهم میزنند و باعث دناتوره شدن BSA میشوند. بنابراین میتوان گفت زمانی که غلظت مایع یونی بالاتر از CMC برود تعداد آنزیمهایی که درون میسلها به دام میافتند افزایش یافته و بنابر این آنزیمهای بیشتری غیرفعال خواهند شد. در رابطه با مایعات یونی که در این پژوهش مورد بررسی قرار گرفت، افزایش فعالیت هیدرولازی را میتوان بر اساس برهمکنشهای هیدروژنی و الکتروستاتیک ایجاد شده بین آنزیم و مایعات یونی آبدوست توضیح داد. این نوع برهمکنشها میتوانند باعث باز شدن نسبی جایگاه فعال آنزیم و در نتیجه دسترسی بیشتر سوبسترا به محل وقوع واکنش شوند. هرچند این مایعات یونی به دلیل اندازه بزرگ کاتیونها، فضای محدودی در اطراف آنزیم ایجاد میکنند که مانع از باز شدن کامل ساختار آنزیم میشوند. بنابراین در عین افزایش فعالیت آنزیمی در غلظت بهینه مایعات یونی آبدوست، پایداری ساختاری آنزیم نیز در این مایعات یونی حفظ میشود. نتایج نشان داد که کاهش فعالیت هیدرولازی TTL در غلظتهای بالاتری از مایعات یونی دارای زنجیره کوتاهتر کربنی مانند [C2MIM][Br] و [C4MIM][Br]، ایجاد میشود. در حالیکه در مورد مایعات یونی با زنجیره کربنی بلندتر مانند [C6MIM][Br]، این کاهش بلافاصله پس از گذشتن از غلظت بهینه اتفاق میافتد. کاتیونهای دارای زنجیره کربنی طویل میتوانند با ایجاد ممانعت فضایی در دهانه جایگاه فعال آنزیم که یک فضای آبگریز است، مانع از ورود سوبسترا و انجام واکنش شوند. این پدیده میتواند دلیلی برای کاهش فعالیت آنزیم در اثر افزایش غلظت مایعات یونی با طول زنجیرههای بلندتر باشد (Ventura et al., 2012).
شایان ذکر است که گزارشات موجود در مورد مایعات یونی دارای آنیون برمید غالبا اثر منفی این نوع از مایعات یونی را بر فعالیت و ساختار آنزیم نشان دادهاند. نوریتومی و همکاران درصد بسیار پائینی از فعالیت آنزیم لیزوزیم را در حضور مایع یونی [C2MIM][Br] نسبت به محیط بافری و مایعات یونی آبگریز گزارش دادند (Noritomi et al., 2011). ساسمال و همکاران [C5MIM][Br] را یک عامل دناتوره کننده برای پروتئین HSA دانستند (Sasmal et al., 2011). یان و همکاران تعداد زیاد برهمکنشهای الکتروستاتیک بین مایعات یونی ایمیدازولیومی با آنیون برمید و آمینواسیدهای آسپارتات و گلوتامات پروتئین BSA را علت باز شدن ساختار BSA گزارش دادند (Yan et al., 2012). این در حالی است که در چنین مطالعاتی اثر غلظت مایعات یونی را بررسی نشده است. مطالعاتی توسط Na در سال 2013 و همچنین Zhao در سال 2006 از معدود مواردی هستند که این موضوع را مورد توجه قرار دادهاند. در این بخش از پژوهش نشان داده شد که مایعات یونی با آنیون برمید نیز میتوانند در غلظتهای خاصی اثرات مطلوب قابل توجهی بر فعالیت آنزیمی داشته باشند.
5-2- اثر مایعات یونی بر پایداری دمایی آنزیم TTL
یکی از شرایط اصلی که میبایست برای بهینه سازی انجام یک فرآیند صنعتی مورد بررسی قرار داد، میزان پایداری آنزیم در شرایط محیطی خاص در دماهای بالا است. مایعات یونی به عنوان محیط واکنش مناسب در فرآیندهای صنعتی بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند. پایداری دمایی آنزیم در محیطهای حاوی مایعات یونی یک شرط مهم برای استفاده از این محیطها در فرآیندهای صنعتی میباشد. در این بخش از پژوهش ابتدا پایداری دمایی آنزیم در محیط آبی و سپس در مخلوطهای آبی مایعات یونی مختلف مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی غیرفعال شدن برگشتپذیر آنزیم لیپاز در دماهای بالا در مایعات یونی [C4MIM][Br] (غلظت 1 مولار) و [C4MIM][PF6] نشان داد که به طور کلی مایعات یونی ایمیدازولیومی با هر کدام از آنیونهای آبدوست و آبگریز، نسبت به محیطهای بافری محیط بهتری را برای حفظ پایداری آنزیم فراهم میکنند. هر چند مایعات یونی آبگریز مانند مایع یونی [C4MIM][PF6] نسبت به مایعات یونی آبدوست مانند [C4MIM][Br]، که در این بخش مورد بررسی قرار گرفت، محیط پایدارکننده بهتری را برای آنزیم TTL ایجاد میکنند.
این باور وجود دارد که حلالهای آلی آبدوست با جذب آب اطراف ملکول آنزیم به سمت خود، باعث باز شدن آنزیم و در معرض قرارگیری باقیماندههای آبگریز درون ساختار پروتئین میشوند (Zaks and Klibanov, 1988). مایعات یونی نیز به طور کلی جزء حلالهای آبدوست و نسبتا قطبی به حساب میآیند. با این وجود نتایج به دست آمده از این پژوهش و همچنین مطالعات دیگر (Liu et al., 2011, Dang et al., 2007, Pan et al., 2010, Ventura et al., 2012) نشان میدهد که مایعات یونی خصوصا مایعات یونی با کاتیون ایمیدازولیوم هرچند با آنیونهای آبدوست میتوانند در غلظتهای کم باعث پایداری و حفظ ساختار آنزیم شوند. این امر احتمالا به دلیل ایجاد شبکههایی از مایعات یونی است که به واسطه کاتیونهای بزرگ شامل زنجیرههای کربنی آنها ایجاد میشودو باعث حفظ آنزیم در ساختار طبیعی خود و کاهش انعطافپذیری ساختار آن در طی زمان دمادهی به آنزیم میشوند. همچنین میتوان افزایش پایداری آنزیم در حضور این مایعات یونی را به تغییرات احتمالی ساختار دوم آنزیم لیپاز مرتبط دانست که در مطالعات ساختاری گذشته نشان داده شده است. در پژوهشی توسط De Diego و همکاران ایجاد ساختار فشرده در آنزیم همراه با افزایش تعداد α-helix و β-sheet یکی از شواهد پایدار شدن آنزیم در محیط مایعات یونی گزارش شد(De Diego et al., 2005).
نمودار پایداری دمایی آنزیم TTL در مایع یونی [C4MIM][PF6] نیز نشان میدهد که در هر دو دمای °C85 و °C90 این نوع مایع یونی به شدت پایداری آنزیم را حفظ میکند. همانطور که در گزارشات پیش از این نیز دیده میشود (Paljevac et al., 2006) طبیعت آبگریز مایع یونی [C4MIM][PF6]، که بیشتر هم به دلیل حضور یون PF6- است، میتواند سبب پایدارسازی آنزیمها شود. این قابلیت بالا احتمالا به دلیل توانایی این مایع یونی در حفظ ملکولهای آب ضروری در محیط پیرامون آنزیم است (Lozano et al., 2005).
همانطور که گفته شد، مایعات یونی با کاتیون ایمیدازولیوم سبب افزایش پایداری آنزیم TTL میشوند. این مایعات یونی بسته به نوع آنیونی که در ساختار خود دارند، شدت اثر پایدارکنندگی متفاوتی را از خود نشان میدهند. در مقایسهای که در این پژوهش مقایسهای بین مایعات یونی [C4MIM][PF6] و [C4MIM][Br] در دماهای بالا (°C 85 و °C 90) انجام شد، مایع یونی دارای آنیون PF6- اثر پایدارکننده بیشتری را برای آنزیم TTL ایجاد کرد.
نوع برهمکنشهای بین آنیون مایعات یونی و آنزیم میتواند شاهد خوبی برای تفسیر علت پایداری بیشتر آنزیم در [C4MIM][PF6] باشد. برهمکنشهای مختلفی که ممکن است بین آنیونها و آنزیم برقرار شود، توسط گروههای مختلفی براساس پارامترهای سولواتوکرومیک و همچنین قطبیت، اندازه و توزیع بار در زنجیره جانبی آمینواسیدها مورد بررسی قرار گرفته است (Tome et al., 2008). گزارشات مختلفی مبنی بر اثر نوع آنیون بر پایداری آنزیم در مایعات یونی وجود دارد. دسته ای از این مطالعات نحوه اثر آنیونها را بر اساس جایگاه قرارگیری آنها در سری هافمیستر توضیح دادهاند. سری هافمیستر(شکل 5-1) در واقع نوعی دسته بندی یونها بر اساس قابلیت آنها در حل کردن و رسوب دادن پروتئین است (Hofmeister F.,1888). به صورت زیر (Zhao et al., 2006):
اثر آنیونها بر اساس این سری بیشتر از کاتیونها است. در پژوهشی توسط Kumar مایعات یونی دارای آنیون کاسموتروپ و کاتیون کائوتروپ بر اساس سری هافمیستر گزینه های مناسبی برای پایدار ماندن آنزیمها پیشنهاد شدند (Kumar et al. 2014). هرچند سری هافمیستر در برخی موارد صدق نمیکند. برای مثال در مورد آنیون PF6- گزارشات مختلفی مبنی بر افزایش پایداری آنزیمها در مایعات یونی دارای این آنیون وجود دارد. از این جمله میتوان پژوهش Ha و همکاران را نام برد که پایداری دمایی بسیار خوبی از آنزیم CALB را در حضور مایعات یونی با آنیون PF6- دیدند (Ha et al., 2008). این در حالی است که جایگاه این آنیون در سری هافمیستر در دسته آنیونهای کائوتروپ و ناپایدارکننده است. در تفسیر چگونگی اثر این آنیون بر پایداری آنزیم، Klahn با بررسی حلالیت آنزیم CALB در 8 نوع مایع یونی مختلف، علت پایداری بیشتر آنزیم در مایعات یونی دارای آنیون PF6- را آبگریزی بالای این آنیون دانست (Klahn et al., 2011). آنیونهای آبگریز مانند PF6- با آنزیم پیوند هیدروژنی برقرار نمیکنند و ملکولهای آب ضروری اطراف آنزیم را حفظ میکنند. بنابراین آسیبی به ساختار طبیعی آنزیم نمیزنند. همچنین در بین آنیونها، آنیونهایی با اندازه کوچکتر و چگالی بار سطحی بیشتر، به تعداد بیشتری در سظح آنزیم تجمع مییابند و بر همکنشهای الکتروستاتیک قویتری با بارهای سطحی آنزیم برقرار میکنند. در این حالت احتمال باز شدن ساختار طبیعی آنزیم به دلیل تعداد بیشتر برهمکنشها با حلال افزایش مییابد. چنین پدیدهای را در مورد مایعات یونی دارای آنیون برمید یا کلرید میتوان دید. به طور متقابل آنیونهای بزرگی مانند PF6- که چگالی بار سطحی کمی دارند، توانایی ایجاد تعداد کمتری برهمکنش الکتروستاتیک با سطح آنزیم دارند. بنابراین کمتر ساختار آنزیم را تحت تاثیر قرار میدهند. با این حال حفظ پایداری آنزیم در چنین محیطهایی همواره با مشکل حل نشدن آنزیم در مایعات یونی آبگریز همراه بوده است (Klahn et al., 2011). حفظ پایداری آنزیم در مایع یونی [C4MIM][PF6] در دماهای بالا پیش از این نیز گزارش شده است (Ha et al., 2008) که با نتایج گزارش شده از پژوهش حاضر مطابقت دارد.
بر اساس نتایج حاصل از بررسی پایداری دمایی آنزیم TTL در مایعات یونی ایمیدازولیومی با طولهای مختلف زنجیره کربنی، مایعات یونی با زنجیرههای 2، 4 و 6 کربنه عملکرد نسبتا مشابهی را در حفظ پایداری آنزیم از خود نشان میدهند. اختلاف زیاد فعالیت باقیمانده آنزیم پس از دمادهی در محیط مایعات یونی نسبت به محیط بافری نشان دهنده اثر بسیار مطلوب مایعات یونی در حفظ پایداری آنزیم است که دلایل احتمالی این اثر پیش از این گفته شد. در این میان [C6MIM][Br] با اختلاف کمی نسبت به [C2MIM][Br] و [C4MIM][Br]، محیط مناسبتری را برای حفظ پایداری آنزیم فراهم میکند.
با مقایسه پایداری آنزیم در این مایعات یونی میتوان دریافت که طول زنجیره کاتیونی اثر کمی در میزان اختلاف پایداری آنزیم در این محیطها دارد. هرچند طولهای بسیار بالای زنجیره کاتیونی مایعات یونی ایمیدازولیومی اثر منفی بر پایداری ساختار آنزیم میگذارند. مایعات یونی که در کاتیون خود زنجیره آلکیلی بلند دارند، در محیط آبی مانند سورفاکتانت عمل میکنند و بر فعالیت و پایداری آنزیم به شدت اثر میگذارند (Greaves et al., 2008, Tariq et al., 2012). گزارشات متعددی مبنی بر اثر طول زنجیره مایعات یونی بر پایداری و فعالیت آنزیمها وجود دارد. Attri و همکاران دریافتند که مایعات یونی با کاتیون ایمیدازولیوم و فسفونیوم هرچقدر زنجیره آلکیل بلندتر و در نتیجه آبگریزی بیشتری داشته باشند عامل پایدارکننده ضعیفتری برای α-کیموتریپسین به حساب میآیند (Attri et al., 2011).
همانطور که در بخش 4-6-2-3 نشان داده شد، با تغییر نوع کاتیون از پایه ایمیدازولیوم به پایه پیریدینیوم تغییر زیادی در میزان پایداری دیده نمیشود. مایع یونی [C5Py][Br] نیز مانند مایعات یونی ایمیدازولیومی با طول مشابه ([C4MIM][Br] و [C6MIM][Br]) باعث حفط پایداری آنزیم در حدود 60 درصد طی یک ساعت دمادهی در دمای °C85 میشود. همچنین مایع یونی [C12Py][Br] به طور مشابهی نسبت به مایع یونی متناظر ایمیدازولیومی ([C12MIM][Br]) هیچ اثر مطلوبی بر پایداری دمایی آنزیم نداشته است. در این مورد Yamamoto و همکاران مشاهده کردند که افزایش طول زنجیره کربنی در مایع یونی [CnPy][Br] باعث ناپایدار شدن آنزیم لیزوزیم میشود (Yamamoto et al., 2011). علت احتمالی این پدیده ایجاد برهمکنشهای آبگریز قوی بین آنزیم و زنجیره بزرگ کاتیونی آبگریز مایع یونی گزارش شده است.
5-3- بررسی ساختار سوم آنزیم در حضور مایعات یونی
اسپکتروسکوپی فلورسانس یک ابزار مرسوم برای بررسی تغییرات کنفورماسیون پروتئین است. در این بخش از پژوهش جهت ایجاد درک بهتر از مکانیسم پایدارسازی آنزیم توسط مایعات یونی از تکنیک فلورسانس جهت بررسی ساختار آنزیم TTL، پس از مجاورت با مایعات یونی مختلف در دمای °C85 و سرد سازی در یخ، استفاده شد.
آنزیم TTL داری دو آمینواسید تریپتوفان در ساختار خود میباشد که در این روش میزان نشر فلورسانس این آمینواسید پس از برانگیخته شدن در طول موج nm 295، مورد بررسی قرار گرفت. بیشینه میزان شدت فلورسانس (IMax) و بیشینه طول موج نشر (λMax)، تغییرات کنفورماسیون آنزیم را در حضور مایعات یونی مختلف و در عدم حضور مایع یونی نشان میدهد (Bekhouche M., 2012). زمانی که ساختار آنزیم باز شود این باقیماندههای کروموفور در معرض حلال آبدوست قرار میگیرند و در نتیجه شدت نشر فلورسانس آنها با قرارگیری در فضای آبدوست کاهش مییابد. البته این امر میتواند به دلیل پوشانده شدن عوامل فلوروفور پروتئین (Trp) توسط یونهای مایع یونی نیز باشد.
کاهش شدید نشر فلورسانس پروتئین به سبب باز شدن ساختار دوم پروتئین و قرارگیری باقیمانده های Trp در معرض حلال آبدوست مشاهده میشود. چنین پدیده ای در اثر حرارت دهی به آنزیم TTL در محیط بافری دیده شد. همانطور که در بخش 4-6-2 این پژوهش نیز نشان داده شد، آنزیم TTL در فضای بافری در دمای ˚C 85 پایدار نیست و در اثر حرارت دهی ساختار آنزیم باز شده و با قرارگیری باقیمانده های Trp در معرض حلال آبدوست، کاهش نشر فلورسانس را سبب خواهد شد.
طیف های نشری فلورسانس آنزیم TTL پس از انکوباسیون آنزیم در مایعات یونی[C4MIM][PF6] و [C6MIM][PF6] و سپس خارج کردن آنزیم از این محیط و وارد کردن آن به فضای آبی، گرفته شدند. بالا بودن شدت نشر فلورسانس در مورد آنزیم انکوبه شده در [C4MIM][PF6] نشان دهنده حفظ فشردگی ساختاری TTL در این محیط، حتی پس از 1 ساعت حرارت دهی در ˚C 85 است. شدت نشر فلورسانس مربوط به [C6MIM][PF6] پایینتر از [C4MIM][PF6] است. هرچند، کاهش λMax در مورد محیط [C6MIM][PF6] را می توان به فشردهتر شدن ساختار پروتئین در این محیط که آبگریزتر و دارای گرانروی بالاتری نسبت به [C4MIM][PF6] است، مرتبط دانست.
بنابراین با توجه به مشاهدات ساختاری بر اساس طیف های فلورسانس و بررسی های سینتیکی فعالیت آنزیمی در حضور این مایعات یونی می توان گفت آنزیم TTL در محیط [C4MIM][PF6] پایداری دمایی بیشتری هم از نظر ساختاری و هم از نظر حفظ فعالیت سینتیکی را داشته است.
بررسی ساختار TTL در محیط [C4MIM][PF6] در زمان های مختلف حرارت دهی نشان میدهد که آنزیم تا حد زیادی ساختار خود را حفظ کرده است. کاهش اندک نشر فلورسانس پس از 30 و 60 دقیقه حرارت دهی در ˚C 85 گویای حفظ باقیمانده های Trp در جایگاه درون ساختاری خود میباشند. همچنین تفاوت زیاد موجود در بیشینه نشر فلورسانس مربوط به آنزیم حرارت داده شده در ˚C 85، نسبت به آنزیم کاملا غیرفعال (2 ساعت حرارت دهی در ˚C100 در بافر تریس mM 50)، بیانگر حفظ پیچیدگی ساختاری در محیط این مایع یونی است. علت این امر همانطور که پیش از این نیز در بخش سینتیکی گفته شد آبگریزی بالای مایع یونی است که سبب حفظ آب ضروری اطراف آنزیم می شود. همچنین بزرگی ملکولهای این نوع مایعات یونی سبب تشکیل ساختارهای شبکه مانندی می شود که انعطافپذیری ملکول آنزیم را کم کرده و در هنگام افزایش دمای محیط مانع از باز شدن ساختار آنزیم و دناتوره شدن پروتئین میشود.
فصل ششم
نتیجه گیری و پیشنهادات