منبع پایان نامه درباره فیزیولوژی

درجه سلسیوس نگهداری نمود.
جداسازی سالمونلا در نمونه گوشت سفید و قرمز
پیش غنی سازی در محیط مایع غیر انتخابی: در این مرحله تلقیح کردن نمونه در Lactos Broth (این محیط به عنوان رقیق کننده استفاده می‌شود) و گرمخانه گذاری آن در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت زمان 16 تا 20 ساعت صورت گرفت. ضروری است قبل از کشت دادن، دمای محیط رقیق کننده به 37-30 درجه سلسیوس رسانده شود.
غنی سازی در محیط مایع انتخابی: تلقیح 1ml کشت حاصل در محیط غیرانتخابی در محیط مایع Selenit enrichment که به صورت 1cc در لوله آزمایش تقسیم شد و گرمخانه گذاری در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت زمان 24 ساعت.
کشت در محیط جامع و شناسایی: از کشت حاصل بر روی محیط جامد انتخابی SS Agar کشت 4 مرحله‌ای تهیه شد و به مدت زمان 24 ساعت در دمای 37 درجه گرمخانه گذاری گردید. نحوه کشت باید به گونه‌ای باشد که تک پرگنه‌های مشخص در سطح آگار ایجاد شود. پرگنه‌های موجود بر روی محیط SS Agar زرد با هاله مشکی است.
انتخاب پرگنه‌ها برای تأیید: از هر پلیت 5 پرگنه انتخاب گردید و بر روی محیط مغزی Notriant Agar کشت داده شد و به مدت 24-18 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس نگهداری و از کشت‌های خالص برای آزمون‌های تأییدی بیوشیمیایی و سرولوژیکی استفاده شد.
آزمون‌های بیوشیمیایی: به وسیله یک سر سوزن حلقه کشت از پرگنه‌های مورد نظر برداشته و در محیط‌های مشروح کشت داده شد.
محیط TSI Agar: با استفاده از کشت که به پرگنه‌های مورد نظر آغشته بود ابتدا سطح مخزن مایل محیط به صورت خطی کشت داده شد آنگاه سوزن را به عمق محیط فرو برده و سپس محیط در دمای 37 درجه سلیسوس به مدت زمان 24 ساعت گرمخانه گذاری شد.
جدول ‏35: تفسیر محیط TSI بر اساس عمق محیط
عمق محیط
تفسیر
زرد رنگ
گلوکز مثبت
تخمیر گلوکز انجام شده است
قرمز رنگ یا بدون تغییر
گلوکز منفی
تخمیر گلوکز انجام شده است
سیاه رنگ
هیدروژن سولفید (H2S) ایجاد شده است
حباب گاز یا شکاف
تولید گاز از گلوکز صورت گرفته است
جدول ‏36: تقسیر محیط TSI بر اساس سطح مایل محیط
سطح مایل محیط
تفسیر
زرد رنگ
لاکتوز یا ساکاروز مثبت
یک یا دو قند مصرف شده است
قرمز رنگ یا بدون تغییر
لاکتوز یا ساکاروز منفی
هیچ نوع قندی مصرف نشده است
محیط Urea Agar: توسط سوزن کشت آغشته شده به پرگنه‌های مورد نظر از کشت خالص، به سطح مایل آگار به صورت خطی کشت داده شد، سپس محیط در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت زمان 24 ساعت گرمخانه گذاری گردید و در فواصل معین بررسی میشد. اگر واکنش مثبت میبود از تجزیه اوره، آمونیاک حاصل میشد که رنگ مصرف قرمز فلفل را به صورتی گلی و به مرور قرمز روشن تغییر می‌دهد. واکنش مثبت اغلب پس از 2 تا 4 ساعت قابل مشاهده خواهد بود. اکثر سالمونلاها از نظر این واکنش منفی بودند.
محیط L-Lysin: توسط سوزن کشت آغشته شده به پرگنه‌های مورد نظر درست زیر سطح مایع محیط را کشت داده و در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت زمان 24 ساعت گرمخانه گذاری شد. واکنش مثبت با ایجاد رنگ بنفش پس از گرمخانه گذاری مشاهده میشد. رنگ زرد نشان دهندۀ واکنش منفی می‌باشد. اکثر سالمونلاها از نظر این واکنش مثبت بودند.
آزمون اندل: مقداری پرگنه مشکوک حاصل را توسط حلقۀ کشت به لوله حاوی5ml محلول تریپتون – تریپیتوفان منتقل و در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت زمان 24 ساعت گرمخانه گذاری شد. پس از گرمخانه گذاری 1ml از معرف کواکس به آن اضافه شد. تشکیل حلقه قرمز رنگ نشان دهنده واکنش مثبت است، حلقه زرد قهوه ای واکنش منفی را نشان می‌دهد. اکثر سالمونلاها از نظر این واکنش منفی بودند.
جدول ‏37: مشخصات سالمونلاها از نظر واکنش‌های بیوشیمیایی
آزمون
نوع واکنش
درصد سالمونلاهایی که واکنش نشان می‌دهند
تشکیل اسید از تخمیر گلوکز در محیط سه قندی TSI
مثبت
100
تشکیل گاز از تخمیر گلوکز در محیط سه قندی TSI
مثبت
9/91
تخمیر لاکتوز در محیط سه قندی TSI
منفی
2/99
تخمیر لاکتوز در محیط سه قندی TSI
منفی
5/99
آزمون های سرولوژیکی: تشخیص وجود آنتی‌ژن‌های O، A، B، C، D سالمونلا با مشاهده آلگوتیناسیون بر روی لام، هنگامی که از پرگنه‌های خالص و آنتی‌سرم‌های مناسب استفاده و پس از حذف سوش‌های خود آلگوتینه صورت گرفته است.
حذف سوش‌های خود آگلوتینه: یک قطره از محلول سرم فیزیولوژی بر روی یک لام شیشه‌ای کاملاً تمیز قرار گرفت. در این قطره مقداری از پرگنه مورد آزمون حل شد تا سوسپانسیون کدورت یکنواخت حاصل شود. لام را به شکل دورانی به مدت زمان 60-30 ثانیه حرکت داده نتیجه آن بر روی یک زمینۀ تیره و ترجیحاً با ذره‌بین مشاهده شد. اگر باکتری‌ها به شکل توده‌هایی کم و بیش مشخص میشدند، سوش مورد استفاده خود آگلوتینه محسوب میشد و نباید در ادامه آزمون‌ها مورد استفاده قرار میگرفت. در غیر این صورت شناسایی آنتی‌ژن‌ها غیر ممکن می‌گردید.
آزمون برای آنتی‌ژن O، A، B، C، D: این آزمون با استفاده از یک پرگنه که خود آگلوتینه نباشد و انجام شد. یک قطره از آنتی‌سرم O بر روی لام تمیز گذاشته و مقداری از پرگنه در آن حل شد تا یک سوسپانسیون یک دست و یکنواخت به وجود آید از آنتی‌سرم چند ظرفیتی و در صورت لزوم یک ظرفیتی یکی پس از دیگری استفاده شد. اگر اگلوتیناسیون اتفاق میافتاد، واکنش مثبت ارزیابی می‌گردید. این روش برای آنتی‌ژن‌های A، B، C، D نیز به همین صورت انجام پذیرفت، اما برای هر آنتی‌ژن از آنتی‌سرم مخصوص به خود استفاده شد.
بیان نتایج: نتایج آزمون را براساس حضور یا عدم حضور سالمونلا در مقدار مورد آزمون نباید از 25gr کمتر باشد.
لاکتوز براث:
روش تهیه : محیط کشت به صورت صنعتی ساخته میشود و طبق دستور العمل کارخانه توسط آب مقطر آماده شد. پس از سترون کردن محیط در اتوکلاو pH آن به گونه‌ای تنظیم شد که در دمای 25 درجه سلسیوس برابر 7 باشد. محیط را در ارلن‌هایی با گنجایش مناسب توزیع نموده و سپس در اتوکلاو به دمای 121 درجه سلسیوس به مدت زمان 20 دقیقه سترون گردید.
Selenit enrichment :
روش تهیه: محیط کشت به صورت صنعتی ساخته شده و طبق دستورالعمل کارخانه توط آب مقطر آماده شد. این محیط نیازی به سترون شدن توسط اتوکلاو نداشت. محیط آماده در لوله‌های آزمایش به انداه 10cc تقسیم میشد.
سالمونلا – شیگلا:
محیط کشت به صورت صنعتی ساخته شده و طبق دستور العمل کارخانه توسط آب مقطر ساخته شد. پس از سترون کردن محیط در اتوکلاو، pH آن به گونه‌ای تنظیم شد که در دمای 25 درجه سلسیوس برابر 7 باشد. محیط در پلیت‌های شیشه‌ای یا یکبار مصرف تقسیم میشد.
محیط آهن‌دار سه قندی (TSI):
روش تهیه:
محیط کامل را که به صورت صنعتی ساخته شده طبق دستورالعمل کارخانه در آب مقطر حل شد. پس از سترون کردن محیط در اتوکلاو، pH آن به گونه‌ای تنظیم شد تا برابر 4/7 باشد. محیط به حجم‌های 10ml در لوله‌هایی با گنجایش مناسب توزیع شد سپس در اتوکلاو در دمای 121 درجه سلسیوس در لوله‌هایی با گنجایش مناسب توزیع گردید و آنگاه در اتوکلاو در دمای 121 درجه سلسیوس به مدت زمان 10 دقیقه سترون شد. لوله‌ها در شیب مناسب قرار داده شد تا پس از انعقاد دارای 2cm عمق و سطح مناسب باشد.
محیط اوره آگار:
روش تهیه:
محیط کامل را که به صورت صنعتی ساخته شده طبق دستور العمل کارخانه در آب مقطر حل نموده. پس از سترون کردن محیط در اتوکلاو، pH آن به گونه‌ای تنظیم شد که برابر 8/6 باشد. محیط در اتوکلاو به دمای 121 درجه سلسیوس به مدت زمان 20 دقیقه سترون شد. سپس به آن محلول اوره را که به صورت آماده وجود داشت توسط فیلتر با کتریولوژی به آن اضافه گردید. برای هر 1000cc از محلول پایه 50cc محلوله اوره به آن اضافه می‌کنیم.
طرز تهیه محلول اوره:
40gr اوره در 100ml آب مقطر حل شد. این کار با استفاده از فیلتر باکتریولوژی انجام گردید. محیط کامل در شرایط سترون به حجم‌های 10ml در لولههایی با گنجایش مناسب توزیع شد لوله‌ها در شیب مناسب قرار داده شد تا منعقد گردد.
محیط L – لیزین دکربوکسیلاسیون:
روش تهیه:
محیط طبق دستورالعمل کارخانه سازنده توسط آب مقطر ساخته شد. پس از سترون کردن محیط در اتوکلاو، pH آن به گونه‌ای تنظیم شد که برابر 8/6 باشد. محیط را به حجم‌های 5ml در لوله‌هایی با گنجایش مناسب توزیع نموده. سپس در اتوکلاو به دمای 121 درجه سلسیوس به مدت زمان 10 دقیقه سترون گردید.
محلول کواکس به صورت آماده خریداری شد.
محیط مغذی نوترینت آگار:
طرز تهیه: محیط کشت کامل طبق دستورالعمل کارخانه سازنده توسط آب مقطرساخته شد وpH آن به گونه‌ای تنظیم گردید که پس از سترون کردن محیط برابر 7 باشد. سپس آن را در لوله‌های استریل تقسیم کرده و در اتوکلاو به مدت زمان 20 دقیقه در دمای 121 درجه سلسیوس سترون شد.
شمارش اشرشیاکلی در گوشت سفید وقرمز:
یک سری سه لوله‌ای از هر دقت آماده شد. به هر یک از سه لوله محیط کشت غنی کننده انتخابی لوریل سولفات با غلظت مضاعف با استفاده از یک پیپت سترون 10ml از سوسپانسیون اولیه انتقال داده شد این مقدار از نمونه برابر با یک گرم نمونه در هر لوله می‌باشد.
سپس به سه لوله محیط کشت غنی کننده انتخابی با غلظت معمولی با استفاده از پیپت سترون دیگری، 1 میلی لیتر از سوسپانسیون اولیه تلقیح شد. این مقدار از نمونه برابر با 0.1gr نمونه در هر لوله می‌باشد.
با استفاده از دقت 1/0 به دست آمده رقت های بعدی مانند 01/0 و 001/0 تهیه گردید. برای هر رقت از پپیت سترون جدید استفاده شد و به دقت لوله های تشت تلقیح شده مخلوط گردید.
لوله های محیط کشت با غلظت مضاعف و لوله‌های محیط کشت با غلظت معمولی در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت زمان 24 ساعت گرمخانه گذاری شد. اگر در این مرحله گاز یا کدورت در لوله هامشاهده نمیشد گرمخانه گذاری 24 ساعت دیگر ادامه مییافت.
اگر بعد از 48 ساعت دوره گرمخانه گذاری کدورت بدون گاز ایجاد میشد ازآن به محیط EC تلقیح میشود.
تلقیح و گرمخانه گذاری آب پپتونه:
با استفاده از حلقه کشت از هر لوله گرمخانه گذاری شده که در آن گاز مشاهده میشد به لوله حاوی آب پپتونه که دمای آن به 44 درجه سلسیوس رسیده بود تلقیح گردید و به مدت زمان 48 ساعت در دمای 44 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری شد.
کشت و گرمخانه گذاری محیط کشت انتخابی (EC) :
از هر لوله محیط کشت با غلظت مضاعف که در آن کدورت یا گاز مشاهده میشد و از هر لوله محیط کشت با غلظت معمولی که فقط گاز در آن مشاهده میشد، به وسیله حلقه کشت به لوله حاوی محیط کشت EC تلقیح گردید.لوله‌های تلقیح شده را درحمام آب گرم و یا گرمخانه در 44 درجه سلسیوس به مدت 24ساعت قرار داده. چناچه در این مرحله هیچ گازی در محیط کشت EC ایجاد نمی‌شد.گرمخانه گذاری تا مدت 48 ساعت دیگر ادامه مییافت.
کشت و گرمخانه گذاری محیط کشت انتخابی (EC) :
از هر لوله محیط کشت با غلظت مضاعف که در آن کدورت یا گاز مشاهده می شد و از هر لوله محیط کشت با غلظت معمولی که فقط گاز در آن مشاهده میشد، به وسیله حلقه کشت به لوله حاوی محیط کشت EC تلقیح میگردید. لوله‌های تلقیح شده درحمام آب گرم و یا گرمخانه در 44 درجه سلسیوس به مدت 24ساعت قرار گرفت. چناچه در این مرحله هیچ گازی در محیط کشت EC ایجاد نشد. گرمخانه گذاری را تا مدت 48 ساعت ادامه مییافت.
تلقیح و گرمخانه گذاری آب پپتونه:
با استفاده از حلقه کشت از هر لوله گرمخانه گذاری شده که در آن گاز مشاهده شود به لوله حاوی آب پپتونه که دمای آن به 44 درجه سلسیوس رسیده بود تلقیح شد و به مدت زمان 48 ساعت در دمای 44 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری شد.
بررسی تولید اندول:
0.5ml از مصرف اندول به لوله های آب پپتونه که گرمخانه گذاری شده

مطلب مشابه :  تحقیق رایگان دربارهطلاق

دیدگاهتان را بنویسید